Abstract
Doubled haploid (DH) technology is widely used in maize breeding because of its ability to produce 100% homozygous inbred lines within a short period of time. This efficiency has made DH technology an attractive tool for maize breeders, allowing its incorporation into breeding programs. This technology also facilitates advanced breeding techniques such as genome editing and the conversion of elite inbred lines into their cytoplasmic male sterility counterparts. The successful integration of DH technology into various maize breeding programs worldwide has spurred extensive research on the genetic basis and mechanisms underlying haploid induction, leading to the identification of key quantitative trait loci (QTL) aimed at improving efficiency and reducing costs. Additionally, new phenotypic markers are being explored for use along with the R1-nj marker to enhance the accuracy of haploid seed and plant identification. Efforts are underway to identify alternatives to colchicine, a toxic and carcinogenic compound commonly used for chromosome doubling. Nondestructive methods, such as nuclear magnetic resonance, Fourier transform Raman spectroscopy, and flow cytometry, are being developed to enable fast and accurate haploid identification and automate the process for large-scale breeding programs. As these advancements improve DH technology, the maize hybrid breeding paradigm is undergoing a substantial transformation. However, several challenges remain unaddressed.
-
Keywords: doubled haploid technology; maize breeding; haploid induction; chromosome doubling; phenotypic markers
서언
옥수수의 반수체 유도 기술은 학술 연구와 종자 회사의 상업 육종 프로그램에서 널리 사용되고 있다(
Bernardo 2014). 배가반수체 기술은 상업용 교잡종 또는 방임수분 유전자원 집단으로부터 동형 접합 계통을 만드는 가장 빠른 방법 중 하나이다. 고전 육종법에 비해 두 세대 만에 동형 접합 계통을 얻을 수 있으며, 반수체 종자에서 염색체 배가된 이배체를 자연적인 이배체와 구분하기 위하여 배가반수체라 부르며 이 계통은 대부분 100% 동형 접합체이다(
Butruille et al. 2015). 전 세계 과학자들의 협력으로 새로운 세대의 반수체 유도 계통이 개발되어 배가반수체 육종 기술은 열대 지역이나 열대 자원에서도 광범위하게 사용할 수 있게 되었다. 최근에는 반수체 유도율과 반수체 종자 식별 방법이 개량된 유도 계통이 개발되어 옥수수 반수체 유도 기술은 매우 효율적인 육종 도구가 되었다. 본 총설에서는 옥수수 육종을 위한 반수체 유도 계통의 유전적 구성과 이의 응용에 대한 최신 정보를 제공하고자 한다.
반수체 유도 및 유전적 기초
배가반수체 계통을 개발하는 전통적인 방법에는 약배양을 통해 반수체인 화분으로부터 캘러스를 유기하고 염색체를 배가시키는 기내(in-vitro) 조직배양 기술이 이용되었으나 본 총설에서 이야기하는 배가 반수체 기술은 반수체를 유도하는 돌연변이 유전자를 이용하여 기내배양 없이 인위적인 교배를 통해 반수체를 식물체 내(in-vivo)에서 유도하는 기술이다. 옥수수 반수체 유도 계통은 부계와 모계 계통이 모두 포함된다. 옥수수 육종에는 주로 모계 반수체 유도 계통이 이용되고 있으며 특정 목적을 위해 부계 반수체 유도 계통도 사용되고 있다(
Chaikam et al. 2019).
부계 반수체를 유도하는 주요 요인은 indeterminate gametophyte (Ig) 유전자로 밝혀졌다(
Pollacsek 1992). 부계 반수체 유도율은 평균 약 1.6%이다(
Kermicle 1994). 부계 반수체 유도 계통은 육종에 널리 사용되지 않는데 W23× Stock 6에서 유래한 WS14 계통은 ig 대립 유전자를 가지고 있으며, 이 계통으로부터 유래한 후속 세대 반수체 유도 계통인 RWS, RWK 및 BHIs는 모계 반수체 유도 계통으로 널리 사용되고 있다(
Lashermes & Beckert 1988). 최근 과학자들은 동원체 히스톤 단백질 H3 (CENH3)에 돌연변이를 가진 반수체 유도 계통을 개발했다. 이 반수체 유도 계통은 이형접합(+/cenh3)의 상태로 부계 및 모계 반수체 유도에 모두 사용될 수 있으나 부계의 반수체 유도를 위해 사용할 때 평균 유도율이 5%로, 모계에서 반수체 유도를 위해 사용할 때인 0.5% 보다 더 높아 부계 반수체 유도 계통으로써의 활용이 더 적합하다 할 수 있다(
Wang et al. 2021). 애기장대(
Arabidopsis thaliana)에서 CENH3 돌연변이를 양방향으로 사용하였을 때 비슷한 반수체 유도율이 확인되었으며, 이는 옥수수의 +/cenh3가 부계 반수체 유도 계통으로 더 적합하다는 것을 확인하는 것이다(
Wang et al. 2023).
자연적으로 발생하는 반수체 옥수수 종자는 1932년 최초로 보고된 후 자연 발생율이 약 0.11%로 확인되었다(
Chase 1949,
Randolph 1932). 반수체 유도 계통의 가장 중요한 이정표는 1959년에 발표된 “높은 반수체 빈도를 가진 계통”이라는 논문을 통해 소개된 Stock6 계통으로 이 후 개발된 모든 반수체 유도 계통은 Stock6 계통으로부터 직간접적으로 유래되었다 할 수 있다(
Coe 1959). 옥수수 반수체 육종에서 사용하는 반수체 유도 계통은 Stock6 계통에 “보라색 배아 마커”로 불리는 R1-nj (colored1-navajo, “나바호”로 읽는다.) 유전자를 함께 이용할 때 육종을 위한 도구로 사용할 수 있었다(
Chase & Nanda 1965). 1970년대부터 1980년대까지 반수체 유도 계통은 주로 러시아에서 연구되어 KMS 및 ZMS와 같은 반수체 유도 계통이 개발되었다. 이 때까지의 반수체 유도 계통들은 Stock6 계통과 비교할 때 높은 유도율을 가지지 못하였다(
Tyrnov & Zavalishina 1984). 이 후 1988년 프랑스에서 개발된 새로운 반수체 유도 계통인 WS14은 2-5% 정도였으며 이는 Stock 6 계통의 2.3% 보다 높았다(
Lashermes & Beckert 1988).
1988년 이후로 반수체 유도 계통의 개발은 1) 반수체 유도율 증가, 2) 반수체를 쉽게 식별할 수 있는 새로운 표현형 마커 탐색, 3) 다양한 유전적 배경을 가진 육종 재료에 대한 반수체 유도 계통 활용 가능성의 세 가지 주요 목표를 가지고 진행되었다. 2020년까지 개발된 계통에서 반수체 유도율은 15%까지 증가하였으며 이러한 계통으로 BHI201, BHI306 및 CSs이 있다(
Trentin et al. 2023b). 높은 반수체 유도율은 반수체 유도 QTL로 알려진 qhir1 및 qhir8에 대한 marker assisted selection에 의해 이루어졌다(
Chaikam et al. 2018,
Chen et al. 2020). 두 번째로 중요한 성과는 반수체 종자를 쉽게 식별할 수 있는 표현형 마커이다. 1984년 이후 개발된 모든 반수체 유도 계통은 반수체 식별 마커로 R1-nj 유전자를 가지고 있다(
Tyrnov & Zavalishina 1984).
종자 단계에서 반수체 식별이 가능한 R1-nj 마커 외 발아 단계에서 반수체 식별을 하기 위하여 옥수수 유근이 붉은 색깔을 띄게 하는 Pl1 (purple plant1) 유전자가 R-nj 마커와 함께 도입되었다(
Chalyk 1999).
Rotarenco et al. (2010)는 이 두 마커와 함께 잎집(leaf sheath)에 보라색 색상이 나타나는 B1 (booster1)를 이용하고자 하였다. 현재 개발된 반수체 유도 계통 UH600는 B1 마커를 BHI306 계통은 Pl1 마커를 R1-nj 마커와 함께 반수체 식별 마커로 이용하고 있다(
Melchinger et al. 2013).
비파괴 검사 기술이 발달함에 따라 육안으로 확인 가능한 표현형 마커 이외에도 핵자기공명분광기 등을 이용한 비파괴 검사를 통한 반수체 종자의 식별을 자동화할 수 있는 표현형 마커의 발굴도 활발히 이루어졌다(
Melchinger et al. 2013,
Mirdita et al. 2014). 중국 농업대학교에서는 옥수수 종자의 지방은 대부분 배에 저장이 되는데 반수체 종자의 배는 이배체에 비해 지방 함량이 반 정도 적다는 사실을 활용하여 R1-nj 마커와 함께 고지방 함유(high oil content) 계통인 CAUHOI를 개발하였다(
Li et al. 2009). 독일 호겐하임대학에서는 고지방 함유 반수체 유도 계통인 UH601 (종실지방함량 11.7%, 반수체유도율=6.6%)와 UH600 (종실지방함량 10.8%, 반수체유도율=10.2%)를 개발하고 반수체 종자 식별에 핵자기공명분광기를 이용함으로써 반수체 종자 선발을 자동화할 수 있게 되었다(
Melchinger et al. 2013,
Mirdita et al. 2014).
2012년 국제옥수수밀연구소(CIMMYT)는 독일 호겐하임대학과 협력하여 열대 기후 적응성이 우수할 뿐 아니라 열대 옥수수 자원에서 반수체 유도가 10%까지 되는 열대 적응 유도 계통(Tropically Adapted Inducer Lines), TAILs을 개발 보급하였다(
Prasanna et al. 2012). 이후 반수체 유도율을 13.1%까지 향상 시킨 2세대 열대 적응 유도 계통, CIM2GTAILs을 선보였다(
Chaikam et al. 2018). 팝콘 자원에서 반수체 육종을 하기 위하여 팝콘 자원의 특성인 타가불화합성을 극복하기 위하여 미국 아이오와 주립대학교에서는 Ga1 대립 유전자를 가지고 있는 반수체 유도 계통인 BHI306을 개발하였다(
Chen et al. 2024). 또한 R1-nj 대립 유전자의 발현을 억제하는 C1-I (inhibitor) 대립인자를 보유한 반수체 유도 계통을 이용하여 일반 반수체 유도 계통과의 교배를 통해 대량의 새로운 유도 계통을 개발할 수 있는 체계도 확립하였다(
Chen et al. 2024). 2020년대에는 유전자 편집 기술이 생물학 관련 연구에서 뜨거운 이슈가 되었는데, 신젠타 과학자들은 옥수수 반수체 유도 계통과 유전자 편집 기술을 결합한 HI-Edit 기술을 개발하였다(
Delzer et al. 2024). 이 기술은 반수체 유도 계통의 화분을 사용하여 목표 식물에 유전자 편집 특성을 전달하며 이 기술을 이용하기 위해서는 반수체 유도 계통이 변형 가능하고 높은 반수체 유도율을 가져야 하는 것으로 알려져 있다. 반수체 유도 기작에 대한 이해를 통해 중국 과학자들은 methimazole과 phosphatidylcholine을 야생형 화분에 처리함으로써 인위적인 반수체 유도형 꽃가루를 만들었으며 이를 통해 유도율을 2.2%에서 17.2%까지 올릴 수 있게 되었다(
Jiang et al. 2022).
Table 1에서 현재까지 개발된 반수체 유도 계통과 유도율 및 주요 특성을
Table 2에서 이와 관련된 유전자의 특성에 대해 정리하였다.
모계 반수체 유도의 유전
옥수수에서 반수체를 유도하는 주동 유전자는 qhir1이며, 이는 분리 집단에서 반수체 유도와 관련된 유전적 변이의 66%와 관련이 있다. 이 유전자는 세 그룹의 과학자들에 의해 독립적으로 발견되어 각각 MATRILIENAL (MTL), ZEA MAYS PHOSPOLIPASE A1 (ZmPLA1), NOT LIKE DAD (NDL)로 명명되어 졌다(
Gilles et al. 2017,
Kelliher et al. 2017,
Liu et al. 2017) 반수체를 유도하는 열성 돌연변이 대립 유전자는 GRMZM2G471240 유전자의 엑손에 4bp가 삽입된 돌연변이로 밝혀졌다. 최근 연구에서는 또 다른 유전자인 qhir8이 bin 9.01에 위치한 DUF679 도메인 막단백질과 관련된 GRMZM2G565053 유전자로써 반수체 유도율의 20%를 설명할 수 있음을 확인했으며, zmpla1/ nld/mtl과 함께 이 돌연변이 대립 유전자가 존재할 때 반수체 유도율이 증가한다는 것을 확인하였다. 이후 ZmDMP라고 명명된 이 열성 돌연변이 대립 유전자는 단일 뉴클레오타이드 치환 돌연변이로 인해 발생하였다는 것이 밝혀졌다(
Zhong et al. 2019). 두 돌연변이 대립 유전자인 zmdmp와 zmpla1/nld/mtl이 이중 열성으로 존재할 때, 반수체 유도율은 단일 zmpla1/nld/mtl 돌연변이와 비교하여 2-6배 증가하였다. 이는 두 비대립 인자 간의 이중 열성 상위에 의해 반수체 유도율이 조절된다는 것을 시사한다(
Trentin et al. 2020). 또한 ZmPLD3라는 유전자를 역유전학(reverse genetics) 기술로 밝혔으며 이 유전자는 zmpla1/nld/mtl 대립 유전자와 함께 시너지 효과를 나타내어 반수체 유도율을 1.19%에서 4.13%로 약 3배 증가시킬 수 있다고 보고되었다(
Li et al. 2021). 반수체를 유도하는 zmpla1/nld/mtl 돌연변이의 기작은 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 폭발적 증가와 관련이 있으며, 이는 정세포 DNA 손상을 초래하고 부본 게놈의 손실을 초래한다는 것이 입증되었다(
Jiang et al. 2022). 이 연구에서는 또한 반수체를 유도하는 새로운 유전자인 ZmPOD65도 확인하였다. 식별된 두 개의 주요 유전자 외에도 전장유전체 연관분석을 통해 일부 중간 및 많은 미동 효과 QTL에 의해 반수체 유도가 조절되고 있으며 52개의 SNP 마커가 이와 관련이 있음을 확인하였고 zmpla1/nld/mtl 근처의 또 다른 주동 유전자 뿐 아니라 애기장대에서 반수체를 유도하는 Kokopelli와의 병렬상동 유전자(orthologous gene)를 10번 염색체상에서 발견하였다(
Nair et al. 2020).
이렇게 밝혀진 zmpla1/nld/mtl, zmdmp, 및 zmpld3 유전자는 열성 동형접합 상태에서 반수체 종자를 유도하지만, 6번 염색체상의 cenh3 결실 돌연변이는 이형 접합(+/cenh3)인 상태에서 야생형과 교배할 때 양방향에서 반수체 종자를 유도하는 것으로 확인되었다(
Wang et al. 2021). CENH3 돌연변이와 Stock6 계통에서 유래한 주동 유전자를 하나의 유도 계통에 합칠 경우 반수체 유도율이 10.2%에서 16.3%로 증가하였다(
Meng et al. 2022).
복어에서 발견된 DNA 메틸화 유전자는 반수체와 이배체에서 서로 다른 메틸화 및 발현 수준을 나타내며 다배수성에 따라 유전자의 효과가 달라짐으로써 반수체 유도에 관여하는 것으로 알려져 있다(
Zhou et al. 2022). 본 연구는 비록 물고기에서 수행되었지만 DNA 메틸화가 식물에서 유전적 변이를 유발할 수 있다는 증거도 있는 만큼 옥수수의 반수체 유도에서도 DNA 메틸화가 관여하고 있을 것이라 추측된다(
Kaeppler & Phillips 1993).
반수체 종자는 스트레스 환경이나 단일 수정 등 여러 요인에 의해 생성될 수 있다. 반수체 유도 계통에 대한 집중적인 유전 연구를 통해 과학자들은 수정 후 염색체 제거를 유도하고 제어하는 몇 가지 주동 유전자를 확인하였으며 모계 반수체 유도 기작에 관한 아래와 같은 이론을 제시하였다.
단일 수정
옥수수 종자는 하나의 정핵이 두 개의 극핵과 결합하여 배유를 형성하고, 또 다른 하나의 정핵이 난핵과 결합하여 배를 형성하는 중복수정의 과정을 거친다(
Dresselhaus et al. 2016). 반수체 종자의 첫 번째 이론은 중복수정이 아닌 단일수정의 결과일 수 있다(
Fig. 1A).
Tian et al. (2018)은 단일 수정과 염색체 제거가 옥수수에서 반수체 유도를 일으키는 기작 중 하나라고 주장하였다. 다양한 유전적 배경을 가진 옥수수 집단에서 단일 수정이 일어난다는 보고가 있었으며 동일 종자의 배유와 배가 서로 다른 화분으로부터 유래된 정핵과 수정된 이종수정(hetero fertilization)이 자연 상태에서 약 1.46% 발생한다고 알려져 있다(
Gao et al. 2011,
Kato 1999).
반수체 유도 기작의 두 번째 이론은 정핵이 난세포와 수정된 후 배에서 부계 염색체가 제거되어 반수체가 된다는 것이다(
Fig. 1B). 2013년 중국 과학자들은 B 염색체를 가진 유도 계통을 화분친으로 사용하여 종자친 교잡종 ZhengDan95B와 교배한 후 B 염색체를 가진 반수체 종자를 확인하였다. 이는 수정이 먼저 일어나고 그 후 부계 염색체가 제거되었음을 증명한 것이다(
Zhao et al. 2013). 이 가설을 뒷받침하는 또 다른 증거로 반수체 배의 염기 서열을 분석한 결과 유도 계통에서 유래된 염색체 DNA 염기서열 일부가 확인된 것이다(
Li et al. 2017). 주동 유전자인 zmpla1/nld/mtl 가 반수체 유도를 제어한다는 것이 확인된 후 염색체 제거 이론은 더욱 확고히 받아들여졌다(
Liu et al. 2017). 추가적인 연구를 통해 zmpla1/nld/mtl 유전자는 세포내 활성 산소의 폭발적인 증가를 초래하고 이로인해 부계 염색체 DNA의 손실을 초래하는 것으로 밝혀졌으며 반수체 배 안에 부계 DNA 조각 일부가 남아 있는 것을 확인하였다(
Jiang et al. 2022).
세포 분열시 동원체는 방추사의 부착 부위를 제공하여 염색체가 새로 생성되는 딸세포로 당겨질 수 있도록 한다. 히스톤 단백질 H3의 돌연변이 유전자인 CENH3는 히스톤 단백질의 구조와 기능을 변경하여 기능 장애를 초래하는 것으로 알려져 있다(
Comai & Tan 2019,
Sanei et al. 2011). 따라서 CENH3의 돌연변이는 정상적인 염색체 분리를 불가능하게 하여 반수체 형성을 초래한다(
Fig. 1C).
옥수수 반수체 유도 계통의 개발
유도 계통 개발을 위한 전통적인 방법
전통적이고 일반적인 옥수수 반수체 유도 계통의 개발은 marker-assisted selection을 통해 반수체 유도 주동 유전자인 zmpla1/nld/mtl 및 zmdmp와 표현형 마커인 R1-nj, Pl1, B1을 약 6세대의 inbreeding과 선발을 통해 진행하는 것이다(
Trentin et al. 2020). 하지만 높은 반수체 유도율을 가진 계통을 최소한의 시간에 대량으로 개발하기 위하여 미국 아이오와 주립대학교의 과학자들은 표현형 마커인 R1-nj의 발현을 억제하는 C1-I 유전자를 가진 반수체 유도 계통을 개발하였다(
Chen et al. 2024). 이 유도 계통을 화분친으로, 일반 유도 계통을 종자친으로 이용하여 교배를 할 경우 배에서 종자친 유래 R-nj 표현형 마커가 발현된 종자는 모두 반수체 종자로 이를 염색체 배가시켜 단 2세대 만에 새로운 반수체 유도 계통의 개발을 완료할 수 있다. 이렇게 개발된 유도 계통 중 일부는 반수체 유도율이 23%를 초과한 것으로 보고되었다.
CENH3 유전자의 유전자 편집
CENH3는 동원체의 방추사 부착점(kinetochore) 복합체를 제어하는 단백질을 인코딩하는 유전자로 애기장대에서 cenh3 L130F라 불리는 CENH3의 돌연변이는 야생형 개체와 교배하였을 때 반수체를 유도하는 것으로 알려져 있다(
Karimi-Ashtiyani et al. 2015). 형질전환된 CENH3 유전자를 이용해 개발된 초기의 반수체 유도 계통은 옥수수에서 최대 3.6%의 반수체를 유도하였다(
Kelliher et al. 2016). 옥수수에서 cenh3 돌연변이 유전자의 이형접합체(+/cenh3) 상태의 반수체 유도 계통은 화분친 또는 종자친의 양방향으로 이용하여 교배함으로써 반수체 종자를 유도할 수 있다. 또한 +/cenh3 유도 계통을 야생형인 계통과 교배함으로써 엘리트 계통을 1대 교잡종의 +/cenh3 반수체 유도 계통으로 빠르게 전환하여 이용할 수 있게 되어 계통의 유지와 활용을 매우 쉽게 만들었다(
Wang et al. 2021). CENH3 유전자를 유전자 편집 기술을 통해 과발현시키고 이를 Stock6 계통에서 유래한 전통적인 반수체 유도 유전자들과 합쳐 새로운 유도 계통을 개발함으로써 Stock6 유래 계통이 가지는 반수체 유도율인 약 6.1%보다 훨씬 높은 16.3%의 유도율을 가지는 계통을 얻을 수 있었다(
Meng et al. 2022). EMS를 이용한 TILLING 기술의 단점을 보완하기 위하여 애기장대의 CENH3 유전자 염기서열 중 아데닌을 구아닌으로 치환하는 “기저 편집(base editing)”이 이용되었으며 이를 통해 반수체 유도 계통이 개발되었다(
Wang & Ouyang 2023).
주요 반수체 QTL의 유전자 편집
옥수수에서 반수체 유도율에 관여하는 2개의 주요 QTL은 qhir1과 qhir8이다. ZmPLA1 유전자는 qhir1에 위치하며 ZmDMP 유전자는 qhir8 위치에 위치한다. ZmPLA1 유전자의 돌연변이는 최초의 옥수수 반수체 유도 계통인 Stock6에서 유래하였다. 과학자들은 유전자 편집 기술을 통해 열대 계통 LM13의 ZmPLA1 유전자 편집을 성공하였다(
Rangari et al. 2023). CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 반수체 유도율이 0.1~0.3%인 ZmDMP 유전자를 knock-out 시킴으로써 이 편집된 유전자가 zmpla1 돌연변이 대립 유전자와 함께 있을 경우 반수체 유도율이 증가하는 것을 확인하였다(
Zhong et al. 2019). 6번 염색체 상의 ZmPLD3 유전자를 편집하면 zmpla1 돌연변이 대립 유전자와 함께 시너지 효과를 나타내는 것으로 나타났다(
Li et al. 2021).
반수체 종자의 식별
국제 옥수수밀연구소의 과학자들은 일반적으로 식물의 활력, 잎의 너비, 색깔, 직립성, 웅수의 불임성을 시각적으로 평가하여 반수체 식물을 식별하며 이를 “최적표준(gold standard)”으로 제시하고 있다. 이 최적표준을 이용한 포장에서의 반수체 식물 식별은 대규모로 식별할 수 있는 장점은 있지만 활력의 차이가 많이 나는 자식계통에서는 잘못된 식별을 초래할 수 도 있다(
Chaikam et al. 2016,
Nair et al. 2020). 염색체 카운팅은 반수체를 식별하는 정확한 방법이지만 세포유전학적인 훈련이 필요하다(
Sekiya et al. 2020). 유세포 분석은 반수체 식별에 가장 정확한 방법 중 하나로 간주되지만 비용이 많이 든다는 단점이 있다(
Ribeiro et al. 2018). 따라서 유도된 반수체를 식별하는 가장 일반적인이고 시간을 절약하는 방법은 종자나 유묘에서 나타나는 표현형에 기초한 표지 인자를 이용하는 것이다.
R1-nj 마커
Nanda & Chase (1966)는 반수체 종자의 식별을 위해 최초로 R1-nj 유전자를 반수체 유도 계통에 활용하였으며 이후 전세계에서 가장 오래 동안 활용되고 있으며 현재까지 개발된 대부분의 반수체 유도 계통에서 이 마커를 활용하고 있다. R1-nj 마커를 가진 반수체 유도 계통과 교배되어 유도된 잠재적 반수체 종자는 배는 색깔이 없고 배유의 호분층에만 보라색 색소가 축적되어 배와 배유 모두에서 보라색 색소가 축적되는 정상적인 이배체와 확연히 구분이 된다(
Fig. 2). 최근에 출시된 일부 반수체 유도 계통은 R1-nj 마커와 함께 아래에서 설명하는 고지방 함유 마커나 붉은 유근 및 초엽 마커와 함께 사용하는 경우도 있다(
Chaikam et al. 2019,
Porotnikov et al. 2022). 이 마커는 생리적으로 성숙한 종자에서 반수체를 식별할 수 있도록 할 뿐만 아니라 기내 배배양시에도 반수체 식별이 가능하다. 이 마커를 사용하면 대부분의 온대형 옥수수에서 적절한 시간과 노동력만으로도반수체 종자를 쉽게 식별할 수 있다.
그럼에도 불구하고 종자의 배와 배유에서 발현되는 안토시아닌 색소는 A1, A2, Bz1, Bz2, C1, C2, R1, Pr1 유전자들의 복합적인 작용으로 나타나게 된다. 이들 대립 유전자의 조합에 따라 종자 색깔이 청동색, 적갈색, 적색, 보라색에서 검보라색까지 다양하게 나타난다(
Coe 1994). R1-nj 마커를 사용하는 경우 이러한 유전자를 가진 자원에서는 반수체 식별이 어렵다. 또한 9번 염색체상에 위치한 C1-I 유전자를 가진 자원에서는 R1-nj 마커를 사용할 수 없는데 이는 C1-I 유전자가 있을 경우 종자의 안토시아닌 발현을 모두 억제하기 때문이다(
Chaikam et al. 2015). 새로운 R1 마커인 R1-SCM2는 신젠타 과학자들에 의해 개발되었는데 R1-nj 대립인자와 비교할 때 더 적은 민감성을 가지고 있어 반수체 식별시 위양성 비율을 줄일 수 있을 것으로 예상된다(
Delzer et al. 2024).
고지방 함유 마커
고지방 함유(high oil content) 마커는 2003년 반수체 종자의 식별에 사용할 수 있음이 처음으로 보고 되었는데 이를 이용한 첫 반수체 유도 계통인 CAUHOI가 중국 과학자들에 개발되었다(
Chen & Song 2003,
Li et al. 2009). 이후 연구에서 핵자기공명시스템을 이용하여 종자의 배 지방 함량 측정을 자동화할 수 있으며 이러한 자동화 시스템은 4초마다 하나의 종자를 스캔할 수 있으며 94%의 높은 정확도를 가짐으로써 반수체 종자 식별에서의 노동력과 비용을 줄일 수 있음이 보고되었다(
Wang et al. 2016). 또한 핵자기공명 스캔시 이중 임계값을 적용함으로써 반수체 종자로 식별된 종자로부터 퇴화된 종자를 분리할 수 있게 됨으로써 정확도를 97.8%까지 높일 수 있었다(
Qu et al. 2021). 핵자기공명분광기를 사용한 자동 분류 기술이 성공적으로 개발된 후 많은 대학, 기관 및 회사에서도 고지방 함량 마커를 다른 표현형 마커와 함께 사용하기 위해 노력하고 있으며 중국 과학자들에 의해 고지방 함량 마커와 함께 더 높은 유도율을 가진 반수체 유도 계통도 개발되었다(
Liu et al. 2022).
붉은 유근 및 초엽 마커
붉은 유근 마커로 이용되는 Pl1 유전자는 광조건 하에서 발현되는 안토시아닌 마커로 발아 단계에서 빛에 노출될 경우 유근의 색깔이 붉은색이 되며 이를 통해 반수체와 이배체를 식별하는데 이용할 수 있다(
Trentin et al. 2020). 이 마커는 종자의 과피나 호분층에서 안토시아닌 발현을 완전히 억제하는 유전자를 가진 자원을 이용한 반수체 유도시 R1-nj 마커와 보완하여 더 다양한 자원을 육종에 이용할 수 있게 한다(
Chaikam et al. 2016). B1과 Pl1 마커가 함께 있을 경우 옥수수 유묘는 검보라색 초엽, 엽신, 줄기를 가지기 때문에 육종 재료가 Pl1 유전자를 가지고 있을 경우 B1 마커가 반수체 식별을 도울 수 있다(
Coe 1994). Pl1 마커를 사용하는 반수체 유도 계통에는 KMS, MHIs, BHI306 (
Chalyk 1999,
Tyrnov & Zavalishina 1984)이 있으며 Pl1 마커와 함께 B1 마커를 가진 반수체 유도 계통에는 PHIs DH 계통(
Rotarenco et al. 2010)이 있다.
반수체 식별을 위한 기타 기술
표현형 마커와 함께 더 빠르고 정확하게 반수체를 식별할 수 있는 다양한 기술이 개발되고 있다(
Kwak et al. 2017). 특히 반수체 식별을 자동화하는 것은 반수체 육종 기술을 적용한 규모 있는 육종 프로그램에서 매우 중요하다. 근적외선분광법을 사용하여 반수체 종자를 자동으로 식별할 수 있으며 정확도는 약 96.16%인 것으로 알려졌다(
Lin et al. 2018). 푸리에변환라만분광법도 반수체 식별에 사용될 수 있으며 반수체 종자의 화학 구조에 대한 추가 정보를 제공하는 비파괴 분석 방법이다(
Rosa et al. 2023). 국제 옥수수밀연구소에서는 배아구조(embryo rescue)를 통한 배배양기술로 배가반수체 육종시간을 2작기에서 1작기 반으로 단축시킬 수 있었다(
Lopez et al. 2023). 또한 이 기술은 보라색 옥수수 자원에서 반수체 유도를 가능하게 한다.
인공지능의 발전과 함께 과학자들은 반수체 종자의 식별에 딥러닝 기술을 시도하고 있다. 사진, 비디오, 사운드, 텍스트 등을 인식하여 학습할 수 있는 딥러닝 모델인 합성곱 신경망(Convolutional Neural Network, CNN) 모델을 적용한 결과 이미지를 통해 반수체 식별이 가능함을 보여주었으며 VGG-19 모델의 반수체 식별 정확도는 94.58%에 이르렀다(
Altuntaş et al. 2019). 후속 연구에서는 그 정확도를 97.07%와 98.5%로 향상시켰다(
Sabadin et al. 2021,
Zhu et al. 2023).
옥수수의 염색체 배가 기술
반수체 유도 계통의 개발과 표현형 마커의 발굴을 통해 반수체를 유도하고 이를 식별할 수 있게 되었다 하더라도 반수체 종자는 발아가 가능하지만 이배체에 비해 식물의 활력이 떨어지며 대부분 불임이며 종자를 생산할 수 없다는 한계를 가지고 있다. 이를 옥수수 육종에 이용하기 위해서는 반으로 줄어든 염색체 수를 회복시켜 다시 이배체로 만들어야 하며 이를 위해 염색체 배가 기술이 향상되어야 한다(
Chaikam et al. 2019).
인공 염색체 배가 기술에 가장 많이 활용되고 있는 것은 콜히친으로 이는 세포 분열 동안 염색체의 분리를 방지하며 딸세포의 절반은 보통보다 두 배 많은 염색체 수를 가지게 된다(
Manzoor et al. 2019). 콜히친을 이용한 염색체 배가를 위하여 식별된 반수체 종자를 발아페이퍼에 치상하여 발아시킨 후 초엽이 약 2 cm 자랐을 때 초엽의 끝을 자른 후 dimethyl sulfoxide (DMSO)와 함께 0.06% 콜히친 용액에 침종 후 깨끗이 씻은 다음 멸균토양에 이식하게 된다(
Prigge & Melchinger 2012). 최근 보고에 따르면, 0.1% DMSO가 혼합된 0.07% 콜히친 용액을 2엽기에 처리함으로써 배가된 유묘의 생존율을 30%에서 52.7%로 증가시켰다(
Kaur et al. 2023). 콜히친은 매우 우수한 염색체 배가 처리제이지만 환경에 대한 독성이 높으며 높은 발암물질로 취급시 각별한 주의가 필요하기 때문에 이를 대체할 물질을 찾아왔다. 아산화질소(N
2O)는 옥수수에서 염색체 배가를 위해 사용되어 4배체 식물을 생성할 수 있다(
Kato & Birchler 2006). 반수체의 염색체 배가를 위한 최근 연구에 따르면, 아산화질소 처리는 콜히친 처리와 유사한 배가 성공률을 보였는데 아산화질소 처리는 배가 성공률이 6.4~33.3% 이었으며 콜히친 처리는 5.0~28.1%의 성공률로 나타났다(
Molenaar et al. 2018). 대체 방법으로, 아미프로포스-메틸(amiprophous-methyl)과 프로나미드(pronamid)와 같은 제초제를 콜히친 대체제로 사용한 실험에서 배가 성공률은 콜히친 처리와 유사하게 나타났다(
Melchinger et al. 2016). 콜히친, 제초제 및 아산화질소 처리에 의한 반수체 배가 비용의 효율성을 비교하였을 때, 아산화질소 처리는 이삭당 $17.1 (USD)였으며, 제초제 및 콜히친 처리는 각각 이삭당 $17.9와 $20.6으로 아산화질소 처리가 가장 비용 효율적인 처리 방법임을 확인하였다(
Molenaar et al. 2018).
반수체 염색체의 자연적인 배가(Spontaneous Haploid Genome Doubling, SHGD, 본 총설에서 “반수체 자연 배가”로 부르기로 한다) 현상은 70년 넘게 관찰되어 왔으며 이 현상에 대한 이해와 기술의 발전은 이를 옥수수 배가 반수체 육종 기술을 향상시키기 위해 사용될 수 있을 것으로 보인다(
Boerman et al. 2020). 독일 호겐하임대학에서는 순환선발을 통해 반수체 자연 배가율을 5%에서 50%로 증가시킬 수 있었는데 이는 콜히친을 통한 전통적인 방법보다 더 많은 배가 반수체 식물(이배체 식물)을 얻을 수 있는 잠재력이 있다는 것을 의미한다(
Molenaar et al. 2019).
반수체 자연 배가 기작은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
Yang et al. (2022)는 세포학적 연구를 통해 옥수수에서 반수체 자연 배가 현상은 감수분열 전 게놈의 배가, 제 1감수분열 중기 염색체 분리 왜곡과 비정상적 제 2감수분열에 의한 결과일 것이라 하였으며 또한 잎과 같은 체세포에서 발생하는 자연 배가 현상은 배조직에서 발생하는 반수체 자연배가와는 독립적으로 발생함으로 밝혔다. 유전 연구를 통해 반수체 자연 배가에 관여하는 주동 QTL을 6번 염색체에서 찾아 qhmf4로 명명하였다(
Ren et al. 2017). 또 다른 연구에서는 5번 염색체상에서 주동 QTL을 찾았는데 이는 전체 변이의 45%를 설명하였다(
Trampe et al. 2020). 매우 높은 주동 QTL 효과와 여러 환경에서의 안정적 발현 수준으로 인해 이 QTL은 옥수수 반수체 육종에서 반수체 자연 배가를 위한 새로운 방법으로 그 활용성이 높을 것으로 예상된다.
옥수수 육종에서 배가 반수체 기술의 응용
배가 반수체 기술을 이용한 자식계통 개발
옥수수 배가 반수체 기술은 전 세계 공공 및 상업 육종에서 많이 활용되고 있으며 전통적인 옥수수 육종 패러다임을 바꾸어 놓았다(
Mcmahon 2017). 배가 반수체 기술을 이용한 옥수수 육종에서
Jumbo et al. (2011)은 자식계통의 조합능력을 개량하기 위해 반수체 유도 전에 육종 재료에 대한 1회의 집단선발(mass selection)을 통해 원치 않는 유전자형을 가진 개체를 제거해야 한다고 하였다. 육종 재료의 유전적 배경 또한 반수체 유도율에 영향을 미치는 것으로 보인다. 상업용 마치종 1대 교잡종이 9.66%의 가장 높은 반수체 유도율을 보였으며 non-stiff-stalk 집단은 7.06%, stiff-stalk 집단은 5.68%로 나타났으며 경립종과 단옥수수계 집단에서 각각 4.03%와 4.62%로 가장 낮은 반수체 유도율을 보였다(
Trentin et al. 2022).
단옥수수계 자원은 안토시아닌 발현 억제 유전자를 가지고 있는 경우가 많아 반수체 식별을 위한 R1-nj 마커와 함께 잎집에 색이 발현되는 유전자를 사용하는 것이 더 효율적이며 제1엽에서 색상 발현이 되지 않는 경우 기공의 크기를 확인하는 것으로 반수체를 식별할 수도 있다(
Sekiya et al. 2020).
Trentin et al. (2022)는 단옥수수계 자원에서 반수체 오분류를 줄이기 위하여 반수체 유도 계통에 R1-nj와 더불어 Pl1 및 B1 마커를 도입할 뿐만 아니라 포장에서 최적표준을 이용하여 추가적인 반수체 식별을 해야 한다고 주장하였다. 여러 반수체 유도 계통이 다양한 찰옥수수 자원에서 효과적으로 품종 개발에 이용될 수 있으며 유도율은 5%에서 14% 정도인 것으로 나타났다(
Cengiz 2022). 팝콘 집단은 타가불화합성(cross-incompatibility) 유전자인 Ga 대립인자를 가지고 있는 경우가 많아 ga/ga 유전자형이 대부분인 반수체 유도 계통의 화분과 교배가 되지 않기 때문에 반수체 유도율이 0%에서 1.2% 범위로 매우 낮으며 평균 0.34% 정도이다(
Silva et al. 2023).
배가 반수체 기술을 이용한 자식계통의 개발에 있어 육종 소재가 되는 자원의 세대는 육종가들의 관심 대상이었다. 일반적으로 F
1 집단은 F
2 집단에 비해 재조합 빈도가 낮은 것으로 알려져 있으며 이로 인해 F
1 집단을 육종 소재로 이용하는 것은 배가 반수체 육종 기술을 이용한 자식계통 개발에는 효과적이지 못할 수 있다.
Showkath Babu et al. (2022)은 줄기섞음병(Fusarium stalk rot)에 대한 저항성 계통과 이병성 계통을 교배한 F
1과 이를 자가수분하여 얻은 F
2 집단으로부터 만든 배가 반수체 자식계통을 검정한 결과 F
2 집단으로부터 만든 자식계통이 유전적 변이 측면에서 더욱 다양한 줄기섞음병에 대한 저항성/이병성 정도를 나타내었음을 보고하였다.
반수체 유도를 위해 사용하는 유도 계통은 대부분 자식계통으로 이들 간의 교배를 통한 1대 교잡종 유도 계통에 비해 식물체의 세력과 화분량이 적은 단점이 있다. 두 반수체 유도 계통 RWS와 RWK-76간의 교배를 통한 1대 교잡종 반수체 유도 계통에 대한 연구에서 1대 교잡종 유도 계통이 식물체의 세력도 우수하며 화분량이 더 많을 뿐 아니라 반수체 유도율도 비슷한 것으로 확인되었다(
Geiger 2009). 뿐만 아니라 잡종 강세로 인해 포장에서의 재배 관리가 더 용이하였다(
Trentin et al. 2023a). 하지만 1대 교잡종 유도 계통은 인공 교배를 통해 종자를 생산해야 하는 반면 순계 유도 계통은 격리포장에서의 방임수분을 통해 쉽게 유지 할 수 있다는 장점이 있다.
배가 반수체 기술은 HI-Edit라고 불리는 유전자 편집 기술 함께 이용될 수 있다. 반수체 유도 계통의 화분을 교배하여 Cas9 단백질과 gRNA를 육종 재료가 되는 종자친의 난세포로 운반시키고 이를 통해 목표가 되는 DNA를 편집한 후 반수체 종자의 염색체를 배가시켜 목표 유전자가 편집된 자식계통을 확보할 수 있다(
Kelliher et al. 2019). 이를 통해 전통적인 유전자 편집 기술의 많은 단점을 극복할 수 있다. 신젠타 육종가들은 이를 이용하여 HI-Edit 기술이 적용된 새로운 반수체 유도 계통을 개발하였는데 이 계통은 형질전환율과 반수체 유도율을 동시에 증가시킬 수 있다(
Delzer et al. 2024).
배가 반수체 기술은 1대 교잡종 종자 생산을 위한 웅성불임 계통의 개발 시간을 획기적으로 줄여줄 수 있다(
Bortiri et al. 2024). 반수체 유도 계통은 웅성불임 세포질(CMS-C)과 +/cenh3 유전자형을 가지며 종자친으로 이용되며 화분친은 웅성불임 근동질계로 변환하고자 하는 엘리트 자식 계통을 이용한다. 교배를 통해 유도된 반수체는 웅성불임 세포질과 엘리트 자식 계통의 염색체를 가지게 되며 염색체 배가 후 엘리트 자식 계통의 모든 특성과 더불어 웅성불임인 근동질계를 얻게 된다.
배가 반수체 기술의 과제와 전망
배가 반수체 기술의 과제
반수체 유도 계통의 성능
반가 반수체 기술을 적용하여 염색체가 배가된 자식계통은 수 세대에 걸친 인공교배를 통해 개발된 자식계통에 비해 동형접합율이 더 높아 식물체의 균일성이 더욱 우수하지만 일부 계통에서는 겹이삭(multiple ears)이 발생하거나 종자가 맺히지 않는 등 안정적인 성능을 가지지 않는 것으로 보고되고 있다(
Jumbo et al. 2011). 애기장대에서 콜히친 처리에 의한 배가 반수체는 자연 배가 반수체에 비해 더 많은 DNA 메틸화 영역을 가진다는 연구 결과에서 볼 때 옥수수 배가 반수체에서 나타나는 원치 않는 이삭 형질은 콜히친 처리에 의한 DNA 메틸화나 아직 안 밝혀진 요인에 의해 발생하는 것일 수 있다(
Piskorz et al. 2023). 콜히친 처리에 의한 배가 반수체의 불안정성을 줄이기 위한 노력으로 배수체 자연 배가 기술에 대한 보다 집중적인 연구가 수행될 것으로 보인다.
낮은 반수체 유도율, 염색체 배가율 및 배가 반수체 식물의 생존율
현재까지 가장 높은 반수체 유도율은 약 15% 정도이며 열대 유도 계통의 경우 유도율이 더 낮으며 팝콘이나 단옥수수를 육종 소재를 이용할 경우 유도율은 더 낮아진다. 또한 일반적인 염색체 배가 방법으로 콜히친을 사용한 경우 그 배가율은 약 30% 정도이고 개선된 방법으로 염색체 배가율은 50%에 그친다. 따라서 육종 소재로부터 최종적인 배가 반수체 식물의 종자를 얻는 성공률은 약 7%에 불과하다(
Delzer et al. 2024,
Kaur et al. 2023). 배가된 반수체 식물(DH
0)로부터 얻을 수 있는 종자의 수는 일반적으로 매우 적어 계통 생산 비용을 증가시킨다. 바이엘 과학자들은 옥수수의 생식생장 초기 단계에 파클로부트라졸(paclobutrazol)을 처리하여 개체당 이삭수를 증가시킴으로써 생산되는 종자의 수를 증가시키는 방법을 개발하였다(
Wu et al. 2020). 열대 옥수수 자원에서의 반수체 유도율을 증가시키기 위하여 새로운 열대 반수체 유도 계통 개발 시 변형일수일렬 선발법이 제안되었는데 이는 선발 주기당 반수체 유도율을 0.4% 증가시키고 이삭당 종자수를 30% 증가시키는 것으로 보고되었다(
Trentin et al. 2023b). 그럼에도 불구하고 아직까지 반수체 유도율, 염색체 배가율 및 배가 반수체 식물의 생존율은 다소 낮은 편이며 이를 개선하기 위한 추가 연구와 기술 개발이 절실히 요구된다.
반수체 식별
반수체 종자의 식별을 자동화하기 위한 많은 노력에도 불구하고 여전히 훈련된 인력에 의존하고 있는데 이 과정은 시간과 노력이 많이 들며 배가 반수체 기술의 비용을 증가시킨다(
Lin et al. 2018,
Melchinger et al. 2013). 딥러닝 기술로 반수체 종자의 식별이 가능하게 되었지만 여전히 잠재적 반수체만을 식별할 수 있으며 잠재적 반수체로부터 퇴화 종자를 분별하는 단계가 요구된다(
Sabadin et al. 2021). 콜히친 처리를 통한 전통적인 염색체 배가로 개발된 새로운 배가 반수체 개발에 드는 비용은 계통당 약 $20 정도이며 콜히친 대체 물질을 이용하더라도 여전히 비용이 많이 든다(
Molenaar et al. 2018). 열대 지역에서는 년 2-3작기로 옥수수를 재배할 수 있기 때문에 배가 반수체 기술의 장점인 육종년한 단축이 큰 장점으로 작용하지 않는다(
Transon 2017). 많은 장점에도 불구하고 배가 반수체 기술의 적용을 위해 인력을 훈련시키고 염색체 배가를 위한 화학 물질을 다뤄야 하는 등의 단점으로 인해 소규모의 육종 프로그램에서 적용하기에는 제한적인 부분이 있다.
배가 반수체 기술의 전망
반수체 유도율의 증가 및 표현형 마커를 통한 반수체 식별의 용이성 증가와 함께 반수체 유도 계통에서 최신 유전자 편집 기술을 함께 활용할 수 있게 되었다. 뿐만 아니라 엘리트 계통의 웅성불임 근동질 계통으로의 전환에 이용될 수 있으며 반수체 자연 배가 기술을 활용하여 반수체 배가에 드는 비용을 줄일 수 있게 되었다. 개별적으로 개발된 이러한 기술들이 전세계 과학자들의 협력으로 통합될 때 많은 육종 프로그램에서 더욱 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 현장에 직접 적용 가능한 기술이 될 것으로 전망한다.
사사
본 연구는 2024년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다(과제관리번호:2021RIS-001, 과제 고유번호: 1345370811).
Fig. 1Models of maternal haploid induction mechanism in maize. (A) Haploid induction by single fertilization (B) Chromosome elimination by inducer gene mtl/mtl (C) Chromosome mis-segregation due to altered chromosome by CENH3.
Fig. 2Example of a putative haploid seed (left) with R1-nj marker expressed only on endosperm aleurone tissue on top of seed compared to a diploid seed (right). Note that the diploid seed shows R1-nj expression not only on the endosperm but also in the coleoptile of embryo. No pigmentation of anthocyanin in the embryo of haploid seed is due to the elimination of paternal chromosome carrying dominant R1-nj allele, resulting in r1 haploid genotype. No elimination of paternal chromosome took place in the endosperm.
Table 1List of haploid inducer lines and their characteristics.
Table 1
|
Inducer name |
Source and major characteristics |
Haploid Induction Rate (%) |
Phenotype marker |
Reference |
|
Stock6 |
USDA |
2.29 |
|
Coe 1959
|
|
PEM |
Purple Embryo Marker, Deklb Agricultural Association, INC |
0.11 |
R1-nj |
Chase & Nanda 1965
Nanda & Chase 1966
|
|
KMS |
Korichnevy marker saratovsky, Rusia derived from Stock 6 |
0.5-3.4 |
Pl1 |
Tyrnov & Zavalishina 1984 |
|
ZMS |
Zarodyshevy marker Saratovsky, Rusia derived from Stock 6 |
2 |
R1-nj |
Tyrnov & Zavalishina 1984
|
|
WS14 |
(French National Institute for Agricultural Research) derived from a cross of W23×Stock 6 |
2-5 |
R1-nj |
Lashermes & Beckert 1988
|
|
KEMS |
Krasnador Embryo Marker Synthetic |
6.3 |
R1-nj |
Shatskaya et al. 1994
|
|
MHI |
Moldovian Haploid Inducer, derived from KMSxZMS |
5.5-6.7 |
R1-nj, Pl1 |
Chalyk 1999
|
|
RWS |
from the university of Hohenheim derived from KEMSxWS14 |
8.1 |
R1-nj |
Röber et al. 2005
|
|
RWK-76 |
University of Hohenheim derived from WS14xKEMS |
9-10 |
R1-nj |
Geiger 2009
|
|
CAUHOI |
Stock 6×Beijing high oil population from China Agriculture University |
2.21 |
R1-nj, high oil content |
Li et al. 2009
|
|
UH400 |
University of Hohenheim derived from KEMS |
7-9 |
R1-nj |
Chang & Coe 2009
Prigge et al. 2011
|
|
PHIs |
Procera Haploid Inducer from Moldova, Derived from MHI× Stock6, Carry B1 and Pl1 markers gene. Haploid can be identified lack of coloration in seedlings |
12.1-14.5 |
R1-nj, B1, Pl1 |
Rotarenco et al. 2010
|
|
TAILs |
(Tropical adapted haploid inducer lines) CIMMYT partnership with Hohenheim University |
8-10 |
R1-nj |
Prasanna et al. 2012
|
|
CAU5 |
China Agriculture University |
10 |
R1-nj, high oil content |
Xu et al. 2013
Trentin et al. 2020
|
|
CAU079 |
China Agriculture University, |
9 |
R1-nj, high oil content |
Xu et al. 2013
Trentin et al. 2020
|
|
UH600 |
University of Hohenheim High oil content oil content 10.8%, B1 marker purple sheaths, husks, and culm. |
10.2 |
R1-nj, B1, High oil content |
Melchinger et al. 2013
Mirdita et al. 2014
|
|
UH601 |
University of Hohenheim High oil content 11.7% |
6.6 |
R1-nj, High oil content |
Melchinger et al. 2013
Mirdita et al. 2014
|
BHI201
(ISURF#04065) |
Iowa State University, B73×RWS and RWK |
8-15 |
R1-nj |
(https://www.plantbreeding.iastate.edu/breeding-programs/maize-doubled-haploid) From 2015 |
BHI306
(ISURF#04099) |
Iowa State University, B73×RWS and RWK, added with Ga1 gene, a partial dent incompatibility to allow action in popcorn background |
8-15 |
R1-nj, Pl1, Ga1 |
(https://www.plantbreeding.iastate.edu/breeding-programs/maize-doubled-haploid), From 2015 |
|
CIM2GTAILs |
CIMMYT second generation tropical adapted inbred lines. |
8.2-13.1 |
R1-nj |
Chaikam et al. 2018
|
|
CSs |
China Agriculture University, specialized haploid inducer lines that enhance the purple pigmentation of crossing immature embryos |
8.15-15.54 |
R1-nj |
Chen et al. 2020
|
|
ISURF#5202 |
C1-I haploid inducer from Iowa State University, C1-I inducer allows the application of DH technology and its advantages to haploid inducer development, Mo47x ISURF#04099, pre-commercial line. |
5.8-12 |
C1-I |
(https://isurftech.technologypublisher.com/technology/48403)
Chen et al. 2024
|
|
19SN952196 |
Haploid inducer line for Genome editing. Syngenta seed. lines Derived from SYN-INBBC34X(RWKS/Z21S//RWKS) with Transformation frequency 58% |
13 |
R1-SCM2 |
Delzer et al. 2024
|
|
19SN952452 |
Haploid inducer line for Genome editing. Syngenta seed. Derived from SYN-INBB34x(RWKS/Z21S//RWKS) with Transformation frequency 13.7% |
>15 |
R1-SCM2 |
Delzer et al. 2024
|
Table 2List of loci or genes that induce in-vivo haploids in maize.
Table 2
|
Name |
Allele |
Gene action |
Location |
Function/characteristic |
References |
MATRILINEAL (MTL)
NOT LIKE DAD (NLD)
Patatin-Like
Phospholipase A (ZmPLA1) |
mtl
nld
zmpla1
qhir1 |
Recessive |
Gene
GRMZM2G471240 (67.86-68.42 Mb) |
- Sperm-specific phospholipase.
- Trigger maize haploid induction, mutant increase HIR to 2%.
- Note that three independent researches found the same gene and allele. |
Kelliher et al. 2017
Gilles et al. 2017
Liu et al. 2017
|
|
ZMDMP |
zmdmp
qhir8 |
Recessive |
Chromosome 9
bin 9.01
GRMZM2G465053 |
- DUF679 domain membrane protein.
- Mutant increase HIRz up 7% when the mutant combination zmpla1-zmdmp |
Liu et al. 2015
Zhong et al. 2019
|
|
Centromere histone H3 (CENH3) |
cenh3 |
Hetero-zygous |
Chromosome 6 |
- Crossing +/cenh3 to wildtype induces haploids in both direction |
Wang et al. 2021
|
|
Zea mays PHOSPHOLOPASE D3 (ZmPLD3) |
zmpld3 |
recessive |
Chromosome 6 |
- Phospholipase expressed specifically in pollen |
Li et al. 2021
|
|
ZmPOD65 |
zmPOD65 |
Hetero-zygous |
Chromosome 5 |
- Perisase 65 controls ROS burst causing sperm DNA breakage. |
Jiang et al. 2022
|
Zm00001d029559
KOKOPELLI |
Not yet named |
Not yet clarified |
Chromosome 10
141.7 Mb |
- Maize cyclin dependent kinase 1
- KOKOPELLI controls cis-antisense siRNA causing HIR in Arabidopsis. |
Trentin et al. 2023a
|
References
- 1. Ahmadli U, Kalidass M, Khaitova LC, Fuchs J, Cuacos M, Demidov D, Zuo S, Pecinkova J, Mascher M, Ingouff M, Heckmann S, Houben A, Riha K, Lermontova I. 2023. High temperature increases centromere-mediated genome elimination frequency and enhances haploid induction in Arabidopsis. Plant Commun 4: 100507.
- 2. Altuntaş Y, Cömert Z, Kocamaz AF. 2019. Identification of haploid and diploid maize seeds using convolutional neural networks and a transfer learning approach. Comput Electron Agr 163: 1-11.
- 3. Bernardo R. 2014. Essentials of plant breeding. Stemma Press. Woodbury, New York, USA..
- 4. Boerman NA, Frei UK, Lübberstedt T. 2020. Impact of spontaneous haploid genome doubling in maize breeding. Plants 9: 369
- 5. Bortiri E, Selby R, Egger R, Tolhurst L, Dong S, Beam K, Meier K, Fabish J, Delaney D, Dunn M, Mcnamara D, Setliff K, Lunny RCM, Gergen S, Dawe RK, Kelliher T. 2024. Cyto-swapping in maize by haploid induction with a cenh3 mutant. Nat Plants 10: 567-571.
- 6. Butruille DV, Birru FH, Boerboom ML, Cargill EJ, Davis DA, Dhungana P, Dill GM, Dong F, Fonseca AE, Gardunia BW, Holland GJ, Hong N, Linnen P, Nickson TE, Polavarapu N, Pataky JK, Popi J, Stark SB. 2015. Maize breeding in the United States: Views from within Monsanto. Plant Breed Rev 39: 199-282.
- 7. Cengiz R. 2022. Maternal haploid waxy maize, environmental effects on grain yield, and quality parameters. PLoS One 17: e0277283.
- 8. Chaikam V, Martinez L, Melchinger AE, Schipprack W, Boddupalli PM. 2016. Development and validation of red root marker-based haploid inducers in maize. Crop Sci 56: 1678-1688.
- 9. Chaikam V, Molenaar W, Melchinger AE, Boddupalli PM. 2019. Doubled haploid technology for line development in maize: technical advances and prospects. Theor Appl Genet 132: 3227-3243.
- 10. Chaikam V, Nair SK, Babu R, Martinez L, Tejomurtula J, Boddupalli PM. 2015. Analysis of effectiveness of R1-nj anthocyanin marker for in vivo haploid identification in maize and molecular markers for predicting the inhibition of R1-nj expression. Theor Appl Genet 128: 159-171.
- 11. Chaikam V, Nair SK, Martinez L, Lopez LA, Utz HF, Melchinger AE, Boddupalli PM. 2018. Marker-assisted breeding of improved maternal haploid inducers in maize for the tropical/subtropical regions. Front Plant Sci 9: 1527
- 12. Chalyk ST. 1999. Creating new haploid-inducing lines of maize. Maize Genet Coop News Lett 73: 53-54.
- 13. Chang MT, Coe EH. Kriz AL, Larkins BA, 2009. Doubled haploids. editors. Molecular genetic approaches to maize improvement. Springer Verlag. Berlin, Heidelberg: pp. 127-142.
- 14. Chase SS, Nanda DK. 1965. Screening for monoloiss of maize by use of a purple embryo marker. Maize Genet Coop News Lett 39: 59-60.
- 15. Chase SS. 1949. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize, and in its component single cross hybrids and inbred lines. Genetics 34: 328-332.
- 16. Chen C, Xiao Z, Zhang J, Li W, Li J, Liu C, Chen S. 2020. Development of In Vivo Haploid Inducer Lines for Screening Haploid Immature Embryos in Maize. Plants 9: 739
- 17. Chen SJ, Song TM. 2003. Identification haploid with high oil xenia effect in maize. Acta Agron Sinica 29: 587-590.
- 18. Chen YR, Lübberstedt T, Frei UK. 2024. Development of doubled haploid inducer lines facilitates selection of superior haploid inducers in maize. Front Plant Sci 14: 1320660.
- 19. Coe EH. 1959. A line of maize with high haploid frequency. AM NAT 93: 381-382.
- 20. Coe EH. Freeling M, Walbot V, 1994. Anthocyanin genetics. editors. The Maize Handbook. NY. Springer Lab Manuals, New York. pp. 279-281.
- 21. Comai L, Tan EH. 2019. Haploid induction and genome instability. Trends Genet 35: 791-803.
- 22. Da Silva HA, Scapim CA, Vivas M, Amaral AT, Pinto RJB, Vivas JMS, Rossi RM, Baleroni AG. 2020. Corn genotypes and crop seasons on the rate of putative haploids with the expression of gene R1-navajo. Pesqui Agropecu Bras 55: e01521.
- 23. Delzer B, Liazng D, Szwerdszarf D, Rodriguez I, Mardones G, Elumalai S, Johnson F, Nalapalli S, Egger R, Burch E, Meier K, Wei J, Zhang X, Gui H, Jin H, Guo H, Yu K, Liu Y, Breitinger B, Poets A, Nichols J, Shi W, Skibbe D, Que Q, Kelliher T. 2024. Elite, transformable haploid inducers in maize. Crop J 12: 314-319.
- 24. Dresselhaus T, Sprunck S, Wessel GM. 2016. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol 26: R125-R139.
- 25. Gao S, Babu R, Lu Y, Martinez C, Hao Z, Krivanek AF, Wang J, Rong T, Crouch J, Xu Y. 2011. Revisiting the hetero-fertilization phenomenon in maize. PLoS ONE 6: e16101.
- 26. Geiger HH. Bennetzen JL, Hake S, 2009. Doubled Haploids. editors. Maize Handbook Volume II: Genetics and genomics. Springer Verlag. Heidelberg: pp. 641-657.
- 27. Gilles LM, Khaled A, Laffaire JB, Chaignon S, Gendrot G, Laplaige J, Bergès H, Beydon G, Bayle V, Barret P, Comadran J, Martinant JP, Rogowsky PM, Widiez T. 2017. Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize. EMBO J 36: 707-717.
- 28. Jiang C, Sun J, Li R, Yan S, Chen W, Guo L, Qin G, Wang P, Luo C, Huang W, Zhang Q, Fernie AR, Jackson D, Li X, Yan J. 2022. A reactive oxygen species burst causes haploid induction in maize. Mol Plant 15: 943-955.
- 29. Jumbo M, Weldekidan T, Holland JB, Hawk JA. 2011. Comparison of conventional, modified single seed descent, and doubled haploid breeding methods for maize inbred line development using germplasm enhancement of maize breeding crosses. Crop Sci 51: 1534-1543.
- 30. Kaeppler SM, Phillips RL. 1993. DNA methylation and tissue culture-induced variation in plants. In Vitro Cell Dev-Pl 29: 125-130.
- 31. Karimi-Ashtiyani R, Ishii T, Niessen M, Stein N, Heckmann S, Gurushidze M, Banaei-Moghaddam AM, Fuchs J, Schubert V, Koch K, Weiss O, Demidov D, Schmidt K, Kumlehn J, Houben A. 2015. Point mutation impairs centromeric CENH3 loading and induces haploid plants. P Natl Acad Sci USA 112: 11211-11216.
- 32. Kato A, Birchler JA. 2006. Induction of tetraploid derivatives of maize inbred lines by nitrous oxide gas treatment. J Hered 97: 39-44.
- 33. Kato A. 1999. Single fertilization in maize. J Hered 90: 276-280.
- 34. Kaur H, Kyum M, Sandhu S, Singh G, Sharma P. 2023. Protocol optimization and assessment of genotypic response for inbred line development through doubled haploid production in maize. BMC Plant Biol 23: 1-9.
- 35. Kebede AZ, Dhillon BS, Schipprack W, Araus JL, Bänziger M, Semagn K, Alvarado G, Melchinger AE. 2011. Effect of source germplasm and season on the in vivo haploid induction rate in tropical maize. Euphytica 180: 219-226.
- 36. Kelliher T, Starr D, Richbourg L, Chintamanani S, Delzer B, Nuccio ML, Green J, Chen Z, McCuiston J, Wang W, Liebler T, Bullock P, Martin B. 2017. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature 542: 105-109.
- 37. Kelliher T, Starr D, Su X, Tang G, Chen Z, Carter J, Wittich PE, Dong S, Green J, Burch E, McCuiston J, Gu W, Sun Y, Strebe T, Roberts J, Bate NJ, Que Q. 2019. One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction. Nat Biotechnol 37: 287-292.
- 38. Kelliher T, Starr D, Wang W, McCuiston J, Zhong H, Nuccio ML, Martinf B. 2016. Maternal haploids are preferentially induced by cenh3-tailswap transgenic complementation in maize. Front Plant Sci 7: 1-11.
- 39. Kermicle JL. Freeling M, Walbot V, 1994. Indeterminate Gametophyte (ig): Biology and use. editors. The Maize Handbook. Springer. New York: pp. 388-393.
- 40. Kwak JS, Kim SI, Song JT, Ryu SW, Seo HS. 2017. Inhibitors targeting ABA biosynthesis and catabolism can be used to accurately discriminate between haploid and diploid maize kernels during germination. Plant Breed Biotech 5: 204-212.
- 41. Lashermes P, Beckert M. 1988. Genetic control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines. Theor Appl Genet 76: 405-410.
- 42. Li L, Xu X, Jin W, Chen S. 2009. Morphological and molecular evidences for DNA introgression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize. Planta 230: 367-376.
- 43. Li X, Meng D, Chen S, Luo H, Zhang Q, Jin W, Yan J. 2017. Single nucleus sequencing reveals spermatid chromosome fragmentation as a possible cause of maize haploid induction. Nat Commun 8: 1-8.
- 44. Li Y, Lin Z, Yue Y, Zhao H, Fei X, Lizhu E, Liu C, Chen S, Lai J, Song W. 2021. Loss-of-function alleles of ZmPLD3 cause haploid induction in maize. Nat Plants 7: 1579-1588.
- 45. Lin J, Yu L, Li W, Qin H. 2018. Method for identifying maize haploid seeds by applying diffuse transmission near-infrared spectroscopy. Appl Spectrosc 72: 611-617.
- 46. Liu C, Li J, Chen M, Li W, Zhong Y, Dong X, Xu X, Chen C, Tian X, Chen S. 2022. Development of high-oil maize haploid inducer with a novel phenotyping strategy. Crop J 10: 524-531.
- 47. Liu C, Li W, Zhong Y, Dong X, Hu H, Tian X, Wang L, Chen B, Chen C, Melchinger AE, Chen S. 2015. Fine mapping of qhir8 affecting in vivo haploid induction in maize. Theor Appl Genet 128: 2507-2515.
- 48. Liu C, Li X, Meng D, Zhong Y, Chen C, Dong X, Xu X, Chen B, Li W, Li L, Tian X, Zhao H, Song W, Luo H, Zhang Q, Lai J, Jin W, Yan J, Chen S. 2017. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase a generates haploid induction in Maize. Mol Plant 10: 520-522.
- 49. Lopez LA, Ochieng J, Pacheco M, Martinez L, Omar HA, Gowda M, Prasanna BM, Dhugga KS, Chaikam V. 2023. Effectiveness of R1-nj anthocyanin marker in the identification of in vivo induced maize haploid embryos. Plants 12: 2314
- 50. Manzoor A, Ahmad T, Bashir MA, Hafiz IA, Silvestri C. 2019. Studies on colchicine induced chromosome doubling for enhancement of quality traits in ornamental plants. Plants 8: 194
- 51. Mcmahon K. 2017. Double haploid induction speeds up plant breeding process. Syngenta Thrive 3: 10-12.
- 52. Melchinger AE, Molenaar WS, Mirdita V, Schipprack W. 2016. Colchicine alternatives for chromosome doubling in maize haploids for doubled-haploid production. Crop Sci 56: 559-569.
- 53. Melchinger AE, Schipprack W, Würschum T, Chen S, Technow F. 2013. Rapid and accurate identification of in vivo-induced haploid seeds based on oil content in maize. Sci Rep 3: 2129
- 54. Meng D, Luo H, Dong Z, Huang W, Liu F, Li F, Chen S, Yu H, Jin W. 2022. Overexpression of modified CENH3 in Maize Stock6-derived inducer lines can effectively improve maternal haploid induction rates. Front Plant Sci 13: 892055.
- 55. Mirdita V, Schipprack W, Melchinger AE. 2014. Identification of in vivo-induced haploid seeds in maize based on oil content. 50th Annual Illinois Corn Breeders School, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana-Champaign, Illinois.
- 56. Molenaar WS, Schipprack W, Brauner PC, Melchinger AE. 2019. Haploid male fertility and spontaneous chromosome doubling evaluated in a diallel and recurrent selection experiment in maize. Theor Appl Genet 132: 2273-2284.
- 57. Molenaar WS, Schipprack W, Melchinger AE. 2018. Nitrous oxide-induced chromosome doubling of maize haploids. Crop Sci 58: 650-659.
- 58. Nair SK, Chaikam V, Gowda M, Hindu V, Melchinger AE, Boddupalli PM. 2020. Genetic dissection of maternal influence on in vivo haploid induction in maize. Crop J 8: 287-298.
- 59. Nanda DK, Chase SS. 1966. An embryo marker for detecting monoploids of maize (Zea mays L.). Crop Sci 6: 213-215.
- 60. Piskorz EW, Xu L, Ma Y, Jiang H. 2023. Doubled-haploid induction generates extensive differential DNA methylation in Arabidopsis. J Exp Bot 74: 835-847.
- 61. Pollacsek M. 1992. Management of the ig gene for haploid induction in maize. Agronomie 12: 247-251.
- 62. Porotnikov IV, Puykkenen VP, Antonova OY, Mitrofanova OP. 2022. The efficiency of molecular markers of the SKr suppressor gene that determines the crossability of common wheat with rye. Ecol Genet 20: 203-214.
- 63. Prasanna BM, Vijay C, George M. Prasanna BM, Chaikam V, Mahuku G, 2012. Doubled haploid technology in maize breeding: an overview. editors. Doubled haploid technology in maize breeding: theory and practice. CIMMYT. pp. 1-8.
- 64. Prigge V, Melchinger AE. 2012. Production of haploids and doubled haploids in maize. Methods Mol Biol 877: 161-172.
- 65. Prigge V, Sánchez C, Dhillon BS, Schipprack W, Araus JL, Bänziger M, Melchinger AE. 2011. Doubled haploids in tropical maize: I. Effects of inducers and source germplasm on in vivo haploid induction rates. Crop Sci 51: 1498-1506.
- 66. Qu Y, Liu Z, Zhang Y, Yang J, Li H. 2021. Improving the sorting efficiency of maize haploid kernels using an NMR-based method with oil content double thresholds. Plant Methods 17: 1-15.
- 67. Randolph LF. 1932. Some effects of high temperature on polyploidy and other variations in maize. P Natl Acad Sci USA 18: 222-229.
- 68. Rangari SK, Kaur Sudha M, Kaur H, Uppal N, Singh G, Vikal Y, Sharma P. 2023. DNA-free genome editing for ZmPLA1 gene via targeting immature embryos in tropical maize. GM Crops Food 14: 1-7.
- 69. Ren J, Wu P, Tian X, Lübberstedt T, Chen S. 2017. QTL mapping for haploid male fertility by a segregation distortion method and fine mapping of a key QTL qhmf4 in maize. Theor Appl Genet 130: 1349-1359.
- 70. Ribeiro CB, Pereira FDC, Filho LDN, Rezende BA, Dias KODG, Braz GT, Ruy MC, Silva MB, Cenzi G, Techio VH, Souza JCD. 2018. Haploid identification using tropicalized haploid inducer progenies in maize. Crop Breed Appl Biot 18: 16-23.
- 71. Röber FK, Gordillo GA, Geiger HH. 2005. In vivo haploid induction in maize - performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding. Maydica 50: 275-283.
- 72. Rosa JC, Uhdre RS, Faria MV, Barth Pinto RJ, Rossi RM, Medina Neto A, Scapim CA. 2023. A new approach to Fourier transform Raman: Identification of haploids in maize (Zea mays). Plant Breeding 142: 632-638.
- 73. Rotarenco V, Dicu G, State D, Fuia S. 2010. New inducers of maternal haploids in maize. Maize Genet Coop News Lett 84: 21-22.
- 74. Sabadin F, Galli G, Borsato R, Gevartosky R, Campos GR, Fritsche-Neto R. 2021. Improving the identification of haploid maize seeds using convolutional neural networks. Crop Sci 61: 2387-2397.
- 75. Sanei M, Pickering R, Kumke K, Nasuda S, Houben A. 2011. Loss of centromeric histone H3 (CENH3) from centromeres precedes uniparental chromosome elimination in interspecific barley hybrids. P Natl Acad Sci USA 108: E498-E505.
- 76. Sekiya A, Pestana JK, Silva MGBD, Krause MD, Silva CRMD, Ferreira JM. 2020. Haploid induction in tropical supersweet corn and ploidy determination at the seedling stage. Pesqui Agropecu Bras 55: e00968.
- 77. Shatskaya OA, Zabirova ER, Shcherbak VS, Chumak MV. 1994. Mass induction of maternal haploids in corn. Maize Genet Coop News Lett 68: 51.
- 78. Showkath Babu BM, Lohithaswa HC, Triveni G, Mallikarjuna MG, Mallikarjuna N, Balasundara DC, Anand P. 2022. Comparative assessment of genetic variability realised in doubled haploids induced from F1 and F2 plants for response to Fusarium stalk rot and yield traits in maize (Zea mays L.). Agronomy 13: 100
- 79. Silva JPAD, Viana JMS, Dias KODG, Silva JC, Tupper VTB, Clarindo WR. 2023. Popcorn (Zea mays L. var. Everta) haploids identified by Navajo phenotype and ploidy level. Front Plant Sci 14: 1176504.
- 80. Tian X, Qin Y, Chen B, Liu C, Wang L, Li X, Dong X, Liu L, Chen S. 2018. Hetero-fertilization together with failed egg-sperm cell fusion supports single fertilization involved in in vivo haploid induction in maize. J Exp Bot 69: 4689-4701.
- 81. Trampe B, Batîru G, Pereira DSA, Frei UK, Lübberstedt T. 2022. QTL mapping for haploid inducibility using genotyping by sequencing in maize. Plants 11: 878
- 82. Trampe B, dos Santos IG, Frei UK, Ren J, Chen S, Lübberstedt T. 2020. QTL mapping of spontaneous haploid genome doubling using genotyping-by-sequencing in maize (Zea mays L.). Theor Appl Genet 133: 2131-2140.
- 83. Transon J. Defourny P, 2017. Synthesis from field survey and literature. editor. Corn crops in Bukidnon, Philippines. Institute of Environment Science for Social Change (ESSC). Philippines: pp. 1-18.
- 84. Trentin HU, Batîru G, Frei UK, Dutta S, Lübberstedt T. 2022. Investigating the effect of the interaction of maize inducer and donor backgrounds on haploid induction rates. Plants 11: 1527
- 85. Trentin HU, Frei UK, Lübberstedt T. 2020. Breeding maize maternal haploid inducers. Plants 9: 614
- 86. Trentin HU, Krause MD, Zunjare RU, Almeida VC, Peterlini E, Rotarenco V, Frei UK, Beavis WD, Lübberstedt T. 2023a. Genetic basis of maize maternal haploid induction beyond MATRILINEAL and ZmDMP. Front Plant Sci 14: 1218042.
- 87. Trentin HU, Yavuz R, Dermail A, Frei UK, Dutta S, Lübberstedt T. 2023b. A comparison between inbred and hybrid maize haploid inducers. Plants 12: 1095
- 88. Tyrnov VS, Zavalishina AN. 1984. Inducing high frequency of matroclinal haploids in maize. Dokl Akad Nauk SSSR 276: 735-738.
- 89. Wang H, Liu J, Xu X, Huang Q, Chen S, Yang P, Chen S, Song Y. 2016. Fully-automated high-throughput NMR system for screening of haploid kernels of maize (corn) by measurement of oil content. PLoS ONE 11: 1-14.
- 90. Wang N, Gent JI, Dawe RK. 2021. Haploid induction by a maize cenh3 null mutant. Sci Adv 7: eabe2299.
- 91. Wang S, Ouyang K. 2023. Rapid creation of CENH3-mediated haploid induction lines using a cytosine base editor (CBE). Plant Biol 25: 226-230.
- 92. Wang Z, Chen M, Yang H, Hu Z, Yu Y, Xu H, Yan S, Yi K, Li J. 2023. A simple and highly efficient strategy to induce both paternal and maternal haploids through temperature manipulation. Nat Plants 9: 699-705.
- 93. Wu MF, Goldshmidt A, Ovadya D, Larue H. 2020. I am all ears: Maximize maize doubled haploid success by promoting axillary branch elongation. Plant Direct 4: 1-8.
- 94. Xu X, Li L, Dong X, Jin W, Melchinger AE, Chen S. 2013. Gametophytic and zygotic selection leads to segregation distortion through in vivo induction of a maternal haploid in maize. J Exp Bot 64: 1083-1096.
- 95. Yang J-W, Liu Z-H, Qu Y-Z, Zhang Y-Z, Li H-C. 2022. Cytological study on haploid male fertility in maize. J Integr Agr 21: 3158-3168.
- 96. Zhao X, Xu X, Xie H, Chen S, Jin W. 2013. Fertilization and uniparental chromosome elimination during crosses with maize haploid inducers. Plant Physiol 163: 721-731.
- 97. Zhong Y, Liu C, Qi X, Jiao Y, Wang D, Wang Y, Liu Z, Chen C, Chen B, Tian X, Li J, Chen M, Dong X, Xu X, Li L, Li W, Liu W, Jin W, Lai J, Chen S. 2019. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize. Nat Plants 5: 575-580.
- 98. Zhou H, Wang Q, Zhou Z-Y, Li X, Sun Y-Q, Shan G, Zheng X-Y, Chen Q, Liu H-J, Wang W, Shao C-W. 2022. Genome-wide DNA methylation and gene expression patterns of androgenetic haplid tiger pufferfish (Takifugu rubripes) provide insights into haploid syndrome. Sci Rep 12: 8252
- 99. Zhu Y, Zhou X, Yao L, An X. 2023. Maize haploid seed selection method based on CNN-SVM. In: Third International Conference on Digital Signal and Computer Communications (DSCC 2023). SPIE, Xi'an. China: pp. 197-201.
