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Korean. J. Breed. Sci. : Korean Journal of Breeding Science

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수박�서 �굴마름병 �수성 � 저항성 양친� 대한 차세대 염기서열 재분�으로 �색� SNP 기반 HRM 분�표지 개발

��수1, 김진�1, �종필1, 김�선1, 김민경1, 허윤찬2, 백창기3, �준대4, �혜�1,*

Development of HRM Markers Based on SNPs Identified from Next Generation Resequencing of Susceptible and Resistant Parents to Gummy Stem Blight in Watermelon

Korean Journal of Breeding Science 2018;50(4):424-433.
Published online: December 1, 2018

�촌진�청 국립�예특작과학� 채소과

�촌진�청 국립�예특작과학� 기�조정과

�촌진�청 국립�예특작과학� �예특작환경과

전�대학� �업�명과학대학 �예학과

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* (E-mail: helee72@korea.kr, Tel: +82-63-238-6674, Fax: +82-63-238-6605)
• Received: October 5, 2018   • Revised: October 9, 2018   • Accepted: October 30, 2018

Copyright: © 2018 by the Korean Society of Breeding Science

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

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  • Watermelon (Citrullus lanatus) is an economically important vegetable crop all over the world, which has functional compounds such as lycopene and citrulline. Gummy stem blight caused by Didymella bryoniae is one of the most devastative diseases in watermelon. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), which are genetic variations occurring between individuals with respect to a single base, were often used to construct genetic linkage maps and develop molecular markers linked to a variety of horticultural traits and resistance to several diseases. In this study, we developed high-resolution melting (HRM) markers based on SNPs generated from NGS resequencing of two parents in watermelon. Plant materials were C. lanatus ‘920533’ (female and susceptible parent), C. amarus ‘PI 189225’ (male and resistant parent), and their F1 and F2 progenies. A total of 13.6 Gbp (‘920533’) and 13.1 Gbp (‘PI 189225’) of genomic sequences were obtained using NGS analysis. A total of 6.09 million SNPs between ‘920533’ and ‘PI 189225’ were detected, and 354,860 SNPs were identified as potential HRM primer sets. From these, a total of 330 primer sets for HRM analysis were designed. As a result, a total of 61 HRM markers that have polymorphic melting curves were developed. These HRM markers can be used for the construction of SNP-based linkage maps and for the analysis of quantitative trait loci (QTLs) related to gummy stem blight resistance.
수박� 채소작물 중 전세계 재배면� 약 3,518천ha로 4위� 해당하는 중요한 작물�다(FAOSTAT 2016). 수박� 약 91%가 수분으로 �루어져 있어 여름철 갈� 해소를 위하여 소비가 많� �며 �한 ��코펜, 시트룰린 등 기능성 물질� 함유하고 있어 건강 �품으로 활용�고 있다(Kim et al. 2013).
�굴마름병� 수박� 비롯한 여러 박과 채소� � 피해를 주는 병으로, ��차가 �고 고온 다습한 조건�서 주로 발�한다(Lee et al. 2016). 발병 시 잎�서는 황갈색� 작� 반�� �기며 �차 � �형 �는 부정형으로 병반� 확대�고, 줄기�서는 회갈색� 불규칙한 병반� 형성�어 심하면 �물체 전체가 고사한다(Skarshaug 1981). 특히 수박�서는 잎, 줄기, 과경 등�서 물관� 마르고 잎� �� 떨어지는 ��� 보�며(Maynard & Hopkins 1999), 착과 �후� 병� 급�히 진전�어 과실� 수확�기 �전� 잎과 �굴� 고사하는 경우가 많다(Kwon et al. 1997).
수박�서 �굴마름병� 방제하기 위해서는 병 발� �전� 약제를 미리 살�하여 예방해야 하며, 심하게 발��는 �장� 경우�는 윤작� 수행해야 한다(dos Santos et al. 2016). 하지만 화학� 방제� 경우 반복�으로 사용�면 �태계 오염� 야기할 수 있고 �산물� 안전성 문제를 유발시킬 수 있으며 재배� 방제 �한 노�력과 비용� 소모�는 측면�서 문제�� 갖고 있다(Wolukau et al. 2007). 병저항성 품종� 개발� �굴마름병 방제를 위한 근본�� 해결책� � 수 있으며, 복합 병해 저항성 유전�를 집�할 수 있기 때문� 효율�� 방법�다(Lou et al. 2013, Norton et al. 1995).
수박�서 �굴마름병 저항성� 지니는 소재는 미국 USDA- ARS (United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service)� 수박 Germplasm Collection�서 보유 중� ‘PI 189225’와 ‘PI 271778’ 등� 있는 것으로 보고�었으며(Sowell 1975, Sowell & Pointer 1962), 최근�는 �굴마름병 저항성� 새로운 ��으로 ‘PI 279461’, ‘PI 526233’ � ‘PI 482283’ 등� 보고�었다(Gusmini et al. 2005). 그리고 ‘PI 189225’는 �수성� ‘Chareston Gray’와 �배하여 나온 분리집단 분�� 통해 그 저항성� 단�� 열성 유전�� db� �해 조절�다고 보고�었지만(Norton 1979), 최근�는 그 저항성� 환경�� 요�� �해 �향� 받는 다수� 유전�가 관여하고 있는 양� 형질로 보고하였기 때문� 명확한 유전양� 규명� 위한 후� 연구가 필요한 �황�다(Gusmini et al. 2017).
수박�서 병저항성� 가진 개체를 효율�으로 선발하고 육종� 필요한 시간� 줄�기 위해서 분�표지 개발과 �용� 관한 연구가 진행�고 있다. 수박 �가루병 저항성 ��� ‘Arka Manik’와 ‘PI 254744’를 �용하여 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) 마커와 high-resolution melting (HRM) 마커가 개발�었다(Han et al. 2016, Kim et al. 2015). �한 수박 �굴쪼김병 race2� 대한 QTL mapping� 진행�었고, 수박�서 호박 노란 모��� 바�러스(Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV) 저항성 관련 CAPS 분�표지가 개발�었다(Branham et al. 2017, Ling et al. 2009). �와 같� 분�표지를 활용한다면 환경 요�� 배제한 유전�형� 분�할 수 있어 표현형 예측 시 정확�가 향��며, �한 �정한 기준� �용�기 때문� 실험�� 따� 조사결과가 변��지 않는 장�� 있다(Dudley et al. 1992, Lande & Thompson 1990).
최근 염기서열 해� 기술� 발달하고 비용� 저렴해지면서 염기서열 정보를 바탕으로 하는 단�염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 정보를 활용한 분�표지가 많� 개발�고 있다(Lee et al. 2013). 그리고 � SNP 정보를 �용한다면 단�마커 분��서 � 나아가 다수� 샘플� 대한 다수� 분�표지 분�� �루어지는 고�대량 유전�형 분�시스템(high-throughput genotyping system)� �용할 수 있다(Thomson 2014, Trebbi et al. 2011).
따�서 본 연구�서는 수박 �굴마름병 �수성 � 저항성� 양친� 대해 차세대 염기서열 재분�(next generation resequencing)� 진행하여 유�미한 SNP를 선발하고, � 정보를 바탕으로 HRM 분�표지를 개발하였다. HRM 분� 방법� 전기��� 필요한 CAPS, SCAR, SSR 등� 분�표지 분� 방법보다 �대�으로 간편하고 결과를 신�히 확�할 수 있으며 분� 비용� 저렴하다(Wittwer et al. 2003). �러한 HRM 분�표지를 활용하여 추후 수박 유전� 연관지� 작성 � �굴마름병 저항성 양� 형질 유전�좌(quantitative trait loci, QTLs) 분� 등� 위한 기초�료로 사용하고� 하였다.
�물재료
�물재료는 �촌진�청 국립�예특작과학� 채소과 과채류연구실�서 2013년 수박 �굴마름병 저항성 ��� Citrullus amarus Schrad. ‘PI 189225’와 �수성 ��� Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai ‘920533’� 분양 받았다(Fig. 1). 2014년� ‘920533’� 모계로 사용하고 ‘PI 189225’를 부계로 사용하여 F1� 확보하였다. 2017년 5월� F1� �가수정하여 F2 종�를 채종하였으며, 11월� F2 종�를 파종하여 F2 �물체 13개체� 잎� 채취하여 DNA 추출� 사용하였다.
Fig. 1
Watermelon fruits of a susceptible line ‘920533’ (A) and a resistant line ‘PI 189225’ (B) to gummy stem blight.
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�굴마름병 저항성 검정
수박 �굴마름병균 접종� 위해 ��한천배지(potato dextrose agar, PDA)를 제작하였다. 수박 �굴마름병균 균주는 �촌진�청 국립�업과학� �업유전��센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)�서 분양 받� 수박 �굴마름병균 KACC40937 (Didymella bryoniae)� 사용하였다. 본 균주� 균사 조�� 떼어 PDA 고체배지� 중앙� 접종하여 25°C 배양기�서 5�간 배양하였다. 수박 �굴마름병균� �공접종� 위한 분��� 형성� 위해 12시간 광조건과 12시간 암조건으로 5�간 배양하였다. �공접종� 위한 현�액� 분���가 형성� PDA 고체배지� 멸균수를 부어 ��를 회수하고, �를 거즈로 걸러 제작하였다. ��현�액� 접종��를 측정하기 위해 Hemocytometer (Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konighofen, Germany)를 사용하여 4×105 cfu⋅mL-1 접종��로 맞춰 저항성 검정� 사용하였다. �공접종� 본엽� 2~3매가 전개� �물체 1개체당 ��현�액� 10 mL씩 분무하였고, 48시간 �안� 25~27°C 암�태�서 습실처리를 실시하였다. �후 25°C �장��서 12시간 광조건으로 처리하였고, 접종 후 5�차부터 �굴마름병� 발� 유무를 조사하였다(Lee et al. 2016). �수성 ��� ‘920533’ 20개체와 저항성 ��� ‘PI 189225’ 20개체� 대해 �� 조사하였으며 저항성 정�는 본엽� 병반면�률� 계산하여 측정하였다.
�물 DNA 추출
수박 �굴마름병 저항성 � �수성 ��� 양친과 F1, 그리고 F2 13개체 �물체 ��으로부터 CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 방법� �용하여 genomic DNA� pellet� 확보하였다(Doyle & Doyle 1990). 그 후 70% Ethanol� 700 L 분주하고 12,000 rpm� 1분간 �심분리를 하면서 2번� 세척� 한 후, 50 L triply-distilled water (TDW)를 넣고 pellet� 녹� 다� NanovueTM plus spetrophotometer (GE Healthcare, USA)를 �용하여 정량하였고, 추출� genomic DNA는 20 ng⋅µL-1 ��로 맞추어 사용하였다.
차세대 염기서열 분� � SNP �색
수박 양친� ‘920533’과 ‘PI 189225’� 어린잎�서 추출� genomic DNA는 � 10 µg� �용하여 차세대 염기서열 분�(next generation sequencing, NGS)� 수행하였다. �물정보분� 업체� 마�로젠(Seoul, Korea)� �뢰하여 전장유전체 염기서열 재분�(whole genome resequencing)� 실시하였다. 수박 표준유전체 정보는 박과 유전체 ��터베�스 홈페�지(http://www.cucurbitgenomics.org)� 공개� C. lanatus subsp. vulgaris cv. 97103� �용하였다(Guo et al. 2013). 수박 표준유전체� 추정� �기는 425 Mbp�고, assembly� 정보는 약 355.2 Mbp로 전체 게놈� 약 83.6%를 차지하였으며 유전체 정보는 DNA 단편조�� 1,793개(353.5 Mbp)� scaffold와 43,342개(321.4 Mbp)� contig로 구성�어 있었다(Table 1).
Table 1
Statistics of reference genome C. lanatus subsp.vulgaris cv. 97103.
Table 1
Estimated genome size (Mbp) Genome assembly size (bp) Genome covered by assembly (%) Genome assembly size except ‘N’ base (bp) Number of scaffolds (Total length of scaffolds, Mbp) Number of contigs (Total length of contigs, Mbp)
425 355,247,419 83.6 321,373,230 1,793 (353.5) 43,342 (321.4)
Resequencing� 염기서열 ��터는 read �성, 표준유전체� 정렬(alignment), SNP �색(variant calling), 기준� �한 SNP 선발(filtering), HRM 프��머 디��� 단계를 거� 분��었다. TruSeq DNA Nano Sample Preparation Kit (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 활용하여 시퀀싱 ��브러리를 제작하였으며, Illumina Hiseq 4000(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)으로 염기서열� 분�하였다. 시퀀싱 결과 얻어진 raw reads� quality 분�� 통한 전처리 과정� 진행하고 BWA (v.0.7.17) 프로그램� �용하여 reference genome� mapping한 후 정렬� reads를 �용하여 SAMtools (v.1.6) 프로그램� 통한 SNP �색� 진행하였다(Li 2011, Li & Durbin 2009).
다�으로 ‘920533’과 ‘PI 189225’ 간� �색� SNP 주위� 400 bp� 해당하는 flanking sequence (amplicon sequence) 정보를 확보하였다. � 중�서 �형접합형(homozygous)� 것과 SNP 종류 중 A/T와 G/C를 제외한 A/G, A/C, T/G, T/C� 것, 그리고 수박 표준유전체� BLASTN (v.2.7.1+)� 진행하여 copy number가 1개� 것, 그리고 genic region� 위치한 것만� 선발하였고(Zhang et al. 2000), 목표로 하는 SNP 부위를 ��하는 high- resolution melting (HRM) 프��머를 디��하였다(Untergasser et al. 2012).
HRM 프��머 제작 � 분�
HRM 반�액� genomic DNA 2.0 L, 10x PCR buffer 2.0 L, 2.5 mM dNTP mixture 1.0 L, Taq DNA polymerase (Takara, Japan) 0.1 L, SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain (Life TechnologiesTM, USA) 1.0 L, 선발� HRM 프��머 10 pmole⋅mL-1 ��로 forward와 reverse �� 0.5 L, 멸균� 3차 �류수(TDW)로 � 20.0 L� 부피를 맞추었다. PCR 반�� PCR machine (Eppendorf, Germany)� �용하였으며, 98°C�서 2분간 denaturation� 수행한 후, 98°C�서 5초간 denaturation, 60°C�서 10초간 annealing � extension 과정� 40회 반복하였다. PCR 산물� CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-rad, CA, USA)� �용하여 70°C�서 94.6°C까지 0.3°C씩 온�를 올리면서 � 온��서 SYTO 9� 형광� 측정하여 melting curve를 그렸고, Precision Melt Analysis 프로그램(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 유전�형� 분�하였다. 온� �가� 따른 형광 �소 그래프� 양�� 분�함으로� 다형성� 보�는 프��머를 최종 선발하였다.
�굴마름병 저항성 검정
�수성 계통� ‘920533’과 저항성 계통� ‘PI 189225’� 대해 유묘 �태�서 � 20개체씩 �굴마름병 저항성 검정� 실시한 결과, ‘PI 189225’� 병반면�률 �균� 약 14.04%였으며, ‘920533’� �균� 약 73.73%�었다. F-검정�서 � 집단� 분산� 등분산� 아니었기 때문�, �분산� 가정한 t-검정� 실시하였으며 그 결과 p<0.001으로 �수성 계통과 �병성 계통�서 유�성� 있는 것으로 나타났다(Fig. 2). 저항성 계통� ‘PI 189225’� 경우 �수성 계통� ‘920533’보다 확연히 뚜렷한 병징� 나타나지 않았는�, �는 Sowell (1975)� 수박 �업 품종과 PI ��� 대해 �굴마름병� 접종하여 ‘PI 189225’가 저항성임� 보고한 결과와 �치하는 것�었다.
Fig. 2
Comparison of resistance to Didymella bryoniae between resistant (‘PI 189225’) and susceptible (‘920533’) watermelon lines. % lesion area means the ratio of gummy stem blight lesion area to total leaf area. Bars on graphs indicate standard error. Three asterisks indicates that the susceptible cultivar represents significantly different values to the resistant cultivar. (Student’s t-test; p<0.001).
KJBS_50_424_fig_2.jpg
양친� NGS 대량 염기서열 분�
수박 유전체 전체를 커버하는 분�표지를 개발하기 위해 양친� ‘920533’과 ‘PI 189225’를 NGS resequencing한 결과, ‘920533’� � 17.8 Gbp� 염기서열�, ‘PI 189225’는 � 16.8 Gbp� 염기서열� 해�하였다(Table 2). � 염기서열�서 필요 없는 부분� 잘�낸(trimming) 결과, ‘920533’� � 13.6 Gbp, ‘PI 189225’는 � 13.1 Gbp� 염기서열� 남았다(Table 2). �는 assembly� 수박 표준유전체 길�� 약 355.2 Mbp� �� 약 38.28배(‘920533’) � 약 36.80배(‘PI 189225’)� 해당한다(Table 2). �한 실제 NGS resequencing� 사용한 염기는 ‘N’ 염기를 제외한 약 321.4 Mbp를 사용하였다(Table 1). Trimmed data를 �용하여 수박 표준유전체 염기서열� mapping한 결과, ‘920533’� 표준유전체� 약 90.13%� 320 Mbp를, ‘PI 189225’는 약 85.92%� 305 Mbp를 커버하였다(Table 2).
Table 2
Statistics of raw reads, trimmed reads, and mapped reads obtained from next generation resequencing data.
Table 2
Plant material Use Raw reads Total reads Mapped reads



Total length (bp) Total length (bp) Trimmed/Raw Genome coverage The number of mapped reads (The ratio of mapped reads, %) Mapped region of reference genome (bp) Reference genome coverage (%)
‘920533 Female parent 17,762,375,526 13,598,385,369 ≒0.77 ≒38.279 80,972,784 (80.0) 320,192,188 90.13
‘PI 189225’ Male parent 116,791,415,024 13,071,171,856 ≒0.78 ≒36.795 87,354,113 (89.84) 305,232,561 85.92
대량 SNP �색 � HRM 프��머 제작
해�� 염기서열� 바탕으로 ‘920533’과 ‘PI 189225’ 간� SNP를 �색한 결과, � SNP 수는 6,086,851개였다(Table 3). �는 C. lanatus 종 내� SNP 개수보다 많� 것��, 그 �유는 ‘PI 189225’가 분류학�으로 유연관계가 먼 C. amarus�기 때문� 종 간� 유전� 차�� �한 것으로 ���다.
Table 3
Summary of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and high-resolution melting (HRM) primer sets between watermelon lines ‘920533’ and ‘PI 189225’.
Table 3
Raw SNP The number of homozygous SNP The number of HRM candidate The number of HRM recommended (single copy)

Total Intergenic region Genic region (HRM primer sets designed)
6,086,851 5,113,361 4,332,440 2,026,130 1,671,270 354,860
앞서 발굴한 6,086,851개� SNP는 그 수가 매우 많아 모� 분�표지로 활용하는 것� 어렵기 때문�, 본 연구�서는 �굴마름병 저항성 연관 수박 유전�지� 작성 방법� 제시하기 위해 분�표지를 �부 선발하여 분�� �용하였다. 양친 계통�서 모� �형접합형(homozygous)� SNP는 5,113,361개였으며, 그 중�서 HRM 프��머 제작 시 melting curve 간� 서로 구분� 잘�는 염기서열 조합� A/G, A/C, T/G � T/C 조합만 선발하였는� 4,332,440개였다(Table 3). 다�으로 SNP 주위� flanking sequence가 전체 genome�서 1개� copy만� 존재하는 SNP는 2,026,130개였고, genic region� 존재하는 것� 354,860개였다(Table 3). � 중�서 수박� � 염색체 별로 고르게 선발하여 최종 330개� HRM 프��머 �� 제작하였다(Supplementary Fig. 1).
HRM 분� � 다형성 있는 프��머 선발
330개� HRM용 프��머 �� �용하여 HRM 분�� 진행하였는�, 프��머 � 1개당 �수성 계통� ‘920533’과 저항성 계통� ‘PI 189225’와 F1 개체, 그리고 F2 13개체 � 16개� genomic DNA 시료를 사용하여 분�하였다. 프��머 � 중 61개는 Fig. 3�서와 같� melting curve 패턴� 나타내어 다형성(polymorphic)� 보�는 분�표지로 �용할 수 있었고, 나머지 269개는 다형성� 나타나지 않는 단형성(monomorphic)� 보였거나 � 개 ��� 위치�서 ���어 melting curve가 복잡해져 분�표지로 활용할 수 없었다(Table 4). 본 연구�서 수박 표준유전체 정보가 불완전한 부분� 있어 게놈� 다른 부위�서 ��한 flanking sequence 지�� 존재해 다수� ��� 완전히 없애지 못하였기 때문� 것으로 ���다. �한 melting curve가 다형성(polymorphic)� 나타내었지만 melting temperature 차�가 거� 없어서 유전�형 분�� 매우 어려울 것으로 예��는 SNP를 제외하였기� 최종 선발� SNP 수가 �었다. 제작한 330개� HRM 분�표지� 염색체 �� 위치는 MapChart (v.2.3)를 �용하여 Supplementary Fig. 1와 같� 물리� 지�� 위치하여 표시할 수 있었다.
Fig. 3
Melting curves of two HRM markers, WGRS095 (A, C) and WGRS240 (B, D), developed in this study. A and B present the form of normalized melt curve, while C and D show us the image of difference curve. a, Plants of ‘920533’ genotype; b, Plants of ‘PI 189225’ genotype; h, Heterozygous plants.
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Table 4
List of 61 SNP markers that were developed into HRM marker type. These markers were polymorphic between ‘920533’ and ‘PI 189225’ using HRM analysis.
Table 4
Marker name z Chromosome SNP position (bp) y Forward primer (5’→3’) Reverse primer (5’→3’)
WGRS002 1 1,043,418 GGTGGTACCCAATTTGTCCCT AACAGGAAGCCGGCTAGAAA
WGRS006 1 3,819,913 GCGATCAAGAGACAAACGGG TGCGAAGGATGCTTGGTTCT
WGRS011 1 9,325,855 AGGTGCTTAGGAGGTGGAGA CCGCCATGAGAGGAGGTTAG
WGRS017 1 20,202,103 ACGGCAAGCAGTGAAGGTAT GGGGAGAGATGATCGAGCAC
WGRS018 1 22,049,812 TGGGAACTGAGAAGACTGCC GACTTCCACTTCCAACCCCT
WGRS028 1 30,705,477 TGGATATTCCCTCGCTCCAA TTGCTGCTCTTCAAATGGGC
WGRS030 1 33,601,876 GGACAAACCTGGCCCACTAA TCGAAAAGCAGCAGAGGCA

WGRS039 2 13,988,030 AACGGAGCTAATCGACGACC ACAAGGCCCAAGAGATTTAGGA
WGRS046 2 26,782,186 GCCCTGTCAGTGAACCATCA ACAGACCTGAGAATCACTAGCT
WGRS048 2 29,195,322 AGCGTGTGGTTTTGACTTGAG AGATGTAATGCGATGCAGTTGC

WGRS054 3 3,074,543 CGTCTCCAACTCCATCTCCG CTGAGGGGGTTGATGACGAG
WGRS061 3 11,069,946 GTGGGAGGGGAAAACGGATT CATTTTCTTCGGAGCTGGCG
WGRS066 3 20,298,449 TGCAGCCCATGAAAGTGCTA GTGTTTATTGTTCCGCCAGCT
WGRS072 3 25,926,099 GCTCTTCCATTGCTCCTGGA GCAGGGTTCTATGGTCGAGT
WGRS074 3 26,809,484 CGCTATCAGCCGACAAAAGC TCGAGGAAGCTTGCACCAAT

WGRS091 4 5,970,325 TGTGCTGATTGTGGACCTCC AGCTTGCTCATTCCTCTCGT
WGRS095 4 8,233,892 GGTGGCCTCACTATTACCGG GGTTTAGAGGTGGAAGGGGTG
WGRS098 4 10,824,802 TAAGACCCAACCGAACTGCC GCAGGCTGCTCTAACAAAGC
WGRS100 4 13,147,227 TGGTAGAAAATGGCAACGCG GATCAAGGACGGGAATGGGA
WGRS101 4 15,102,363 GGCAAAAGCAGACCCTGTTG CCAGTTCCACCAAGCAAACC
WGRS107 4 17,910,257 TGCCAAGAGAATGCAACACG ATGGAGGACATTGCTTGCCA

WGRS121 5 1,577,748 GGGGTTCCATTCCCTAAGGG GGCGAGATGGTCAAACTCCT
WGRS122 5 2,108,735 AGAACCCCCAACCAAAGCTT TCCCCTGCCTTTGCTTGATT
WGRS124 5 4,255,857 CCAGGCATCCAATCGAGGAA CGTCCATAAAGTTGTGGCCC
WGRS126 5 6,580,137 AGTCCGTTGTCCAGTTTCGA AACAGTAGCCCAAGAGCTGG

WGRS148 6 36,471 GTGCTGCTCCTGGTCTCTAA ACTCAATGGGTGCTTGTGGT
WGRS151 6 1,670,897 GCCATTTGATTCCTCACCGC GAGCTGCCCGTAATGCAATG
WGRS152 6 2,870,018 GCTGCGATCGTGTTCACATC CAGAGGCCAAGACCCAGAAT
WGRS170 6 18,074,367 GCTGTGCTTCTTGTGGCAAA AGAGAACATCAACACGGCGT
WGRS171 6 19,159,722 AGAGCTTTTCGTCATGGCCA TCCAGGTTTGGTTTCCGACA
WGRS172 6 20,013,243 TAGGTCAGCCCTCCCTCAAA CGTTCGAGTAATCCTCCGGG
WGRS174 6 21,093,377 TGGAGTGTTTGACTGTGGGG TCTCCATCTCCAGCCATCCT
WGRS177 6 22,055,693 AAGTGGCAATACCTGACCCC ACTACTCTGCAGCTCATGGC
WGRS186 6 26,890,432 CCTGCTTGTGGACCTGGAAT GCAACCATGCGCACATAACT

WGRS190 7 3,830,477 ATCCGCAGATTCACAGGGAG GGCGCTTAAATCTGGTTCCC
WGRS194 7 6,714,580 CGTTGTTTGCAAGCTCCCAA GCCTCCGCTTCCGATTCTTA
WGRS200 7 16,377,893 AGAATCTTGCCACCTTAGGG TCGGTGGTGACTGAGAAACA
WGRS203 7 21,480,403 AATTGGAGGGTCAAGGGGTG TGCTCGTTTCATCAAAAGCCA
WGRS208 7 26,134,906 TGGGCTACATTGTTCTGCCT GCTTCAAGTTTCCTTGCCTGT
WGRS209 7 27,405,979 TGGTGGTGGAGGCAATCAAA GGGGGTTATGCCTGAAACAA
WGRS212 7 30,620,572 TGCTTGGGTTGTATCACTGACA TGGTGTGGCAGGTAATTGGA
WGRS213 7 31,054,142 AATTCTTTGCGCACTCGTGG ATCCACTCTGAGCAATTGGC

WGRS220 8 7,024,617 AACAGTCAACACCCAGCCTT TTGAGGTGGTCTTTCCGAGC
WGRS221 8 7,889,760 GTGACAACCAAGCAGCACTG TCCTGCCCAACTTGTTCCTC
WGRS225 8 10,733,107 CTTCTGCCATTAAACGCCCA GGGTTCAATCATTGTGGTCACC
WGRS226 8 11,279,464 TGCTGGCCCCACTCAATAAA AGGACCGGGTCTCAATCTCA
WGRS227 8 11,656,539 AGTTCTAACGACACGAGGGC TTGTACCAGACTGCGAGCAA
WGRS229 8 15,003,269 CCTTGTGCAACCAAAGCTGT GACAGCGGTTGCATCAGTTC
WGRS233 8 17,637,101 GTAGACACTCTTAGCCGGGC TCCTGCATTGTGTGGTTCCA
WGRS235 8 18,473,596 ACTGTGTGCACTCACCTGTT CGGACATCTGCTGAGGAGTT
WGRS240 8 20,663,001 ACGGCTGGTCTCATGTTCAA TAGGGTTTGGTGCTGGTGAC

WGRS254 9 4,555,267 TGGCTAACCATGGGTTGCAT AGTTTGTTCCAGCGCCATTG
WGRS263 9 16,573,290 GAGTGCTGATGGAAGCTGGA TGCTCCATATGGAAGCAAGTCA
WGRS271 9 29,654,845 TGCACATTGTGTCACTCTACGA CATTGCCTAGAATTTGCCGGG
WGRS272 9 30,799,073 CTAGATTCCTGCGGATGCCT ACCCATACCTTCTCGCGAAA

WGRS281 10 6,101,884 GCCGGTAGTTTCTGACCCAA AGGTTCAAGAAGTGGCGGAG
WGRS287 10 14,082,501 ACAATGCCTCCACCTTTCCA GTAGCAGCAACAGTGGCAAA
WGRS297 10 27,692,702 TGGCAGTGTTGTACTTGGGT AGGGCTTGGAGACTTTTGCA

WGRS307 11 6,959,074 GAGGGTGAGTTTCTGGTGGG CACGCACACTTCACGCTTAA
WGRS316 11 14,891,680 GTGCCTCTGCTTCTCAGGTT TGGCAGTTTTAGGCTTTTCAGT
WGRS326 11 24,272,773 CAGGTTCCTGAAGCAGCTGA GCTGAATCTACCAGGCAACA

zSNP (HRM) markers developed in this study and WGRS is the abbreviation for watermelon gummy stem blight resistance SNP.

yPosition of SNP on reference genome.

�전� 수박 �굴마름병 저항성 관련하여 ��한 양친 재료를 바탕으로 HRM 분�표지를 선발한 연구가 있었다(Lee et al. 2015). 하지만 � 연구�서는 GS FLX 454 Titanium (Roche, Basel, Switzerland) NGS 분�으로 �어낸 염기서열� 길�가 최대 73 Mbp�었기 때문� ��터 �기가 매우 작았으며, �로 �하여 충분한 수� SNP를 발굴하지 못하였다. Rotor-Gene Q Real-Time PCR machine system (Qiagen, Venlo, Netherlands)� �용한 HRM 분�� 통해 다형성� 보�는 14개� SNP를 확�하였지만, 오� 양친 genomic DNA� 대해서 �용� 하였고 F1과 F2 개체� �용� 하지 않아 집단 개체� 대해 유전�형 분�� 가능한 HRM 프��머 �� �욱 줄어들 수 있었다. 따�서 충분한 수� SNP 정보를 확보하고 보다 대량� HRM 프��머 �� 제작하여 다형성 있는 분�표지를 개발하는 것� 차후� 유전�지�를 작성하는 것� �움� � 것�� �단하였다.
본 연구를 통해 수박 �굴마름병� �수성 ��과 저항성 ��� NGS resequencing 함으로� HRM 분�표지로 활용할 수 있는 61개� 프��머 �� 최종 선발할 수 있었다. 해당 HRM 분�표지를 활용하여 F2 178개체 전체� 대하여 유전�형 분�� 진행하고, 분�표지 간� 거리를 계산하여 유전�지�를 작성할 수 있� 것�다. �한 기존� HRM 형태 �외� 다른 형태로 개발� 분�표지를 추가하여 유전�지�를 통합할 수� 있� 것�다. � 나아가 F2 분리집단 개체� 대해 �굴마름병 병저항성 검정� 실시하여 정확한 표현형� 측정한다면 �굴마름병 저항성과 관련� QTL 분�� 수행하는 � 유용하게 활용� 수 있� 것�다.
수박(Citrullus lanatus)� 전세계�서 경제�으로 중요한 채소작물�며, ��코펜과 시트룰린과 같� 기능성 물질� 함유하고 있다. Didymella bryoniae 병�균� �해 발�하는 �굴마름병� 수박 재배�서 가장 피해를 많� 주는 병해 중� 하나�다. 단�염기다형성(SNP)� 한 개 염기� 관해 개체 간� 발�하는 유전� 변�로서 유전� 연관 지�를 작성하는 것과 �예� 형질 � 병저항성� 연관� 분�표지를 개발하는 � �주 사용�다. 본 연구�서는 수박�서 모친과 부친� 차세대 염기서열 재분�(next generation resequencing)� 통해 SNP 분�표지를 선발하였다. �물재료는 C. lanatus ‘920533’(모친, �수성)과 C. amarus ‘PI 189225’(부친, 저항성) � �들� F1, F2 개체를 �용하였다. NGS 분� 결과, ‘920533’과 ‘PI 189225’�서 �� 13.6 Gbp와 13.1 Gbp� 염기서열� 얻었다. ‘920533’과 ‘PI 189225’ 간� SNP 수는 609만 개였고, 그 중 HRM 프��머로 디��� 가능한 SNP� 수는 354,860개였다. 그 중� HRM 분�� 위한 330개 프��머 �� 디���었다. 결과�으로 HRM 분�� 통해 � 61개� HRM 분�표지를 개발하였다. �번 연구� 결과는 SNP 기반� 유전�지� 작성� �용� 수 있으며 �굴마름병 저항성과 연관� 양� 형질 유전�좌(QTL) 분�� 활용� 수 있� 것�다.
본문� Supplementary Fig. 1� 한국육종학회지 홈페�지�서 확�할 수 있습니다.
본 논문� �촌진�청 연구사업(과제번호: PJ00926101)� 지�� �해 �루어졌습니다.
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Development of HRM Markers Based on SNPs Identified from Next Generation Resequencing of Susceptible and Resistant Parents to Gummy Stem Blight in Watermelon
Korean. J. Breed. Sci.. 2018;50(4):424-433.   Published online December 1, 2018
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Development of HRM Markers Based on SNPs Identified from Next Generation Resequencing of Susceptible and Resistant Parents to Gummy Stem Blight in Watermelon
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Fig. 1 Watermelon fruits of a susceptible line ‘920533’ (A) and a resistant line ‘PI 189225’ (B) to gummy stem blight.
Fig. 2 Comparison of resistance to Didymella bryoniae between resistant (‘PI 189225’) and susceptible (‘920533’) watermelon lines. % lesion area means the ratio of gummy stem blight lesion area to total leaf area. Bars on graphs indicate standard error. Three asterisks indicates that the susceptible cultivar represents significantly different values to the resistant cultivar. (Student’s t-test; p<0.001).
Fig. 3 Melting curves of two HRM markers, WGRS095 (A, C) and WGRS240 (B, D), developed in this study. A and B present the form of normalized melt curve, while C and D show us the image of difference curve. a, Plants of ‘920533’ genotype; b, Plants of ‘PI 189225’ genotype; h, Heterozygous plants.
Development of HRM Markers Based on SNPs Identified from Next Generation Resequencing of Susceptible and Resistant Parents to Gummy Stem Blight in Watermelon

Statistics of reference genome C. lanatus subsp.vulgaris cv. 97103.

Estimated genome size (Mbp) Genome assembly size (bp) Genome covered by assembly (%) Genome assembly size except ‘N’ base (bp) Number of scaffolds (Total length of scaffolds, Mbp) Number of contigs (Total length of contigs, Mbp)
425 355,247,419 83.6 321,373,230 1,793 (353.5) 43,342 (321.4)

Statistics of raw reads, trimmed reads, and mapped reads obtained from next generation resequencing data.

Plant material Use Raw reads Total reads Mapped reads



Total length (bp) Total length (bp) Trimmed/Raw Genome coverage The number of mapped reads (The ratio of mapped reads, %) Mapped region of reference genome (bp) Reference genome coverage (%)
‘920533 Female parent 17,762,375,526 13,598,385,369 ≒0.77 ≒38.279 80,972,784 (80.0) 320,192,188 90.13
‘PI 189225’ Male parent 116,791,415,024 13,071,171,856 ≒0.78 ≒36.795 87,354,113 (89.84) 305,232,561 85.92

Summary of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and high-resolution melting (HRM) primer sets between watermelon lines ‘920533’ and ‘PI 189225’.

Raw SNP The number of homozygous SNP The number of HRM candidate The number of HRM recommended (single copy)

Total Intergenic region Genic region (HRM primer sets designed)
6,086,851 5,113,361 4,332,440 2,026,130 1,671,270 354,860

List of 61 SNP markers that were developed into HRM marker type. These markers were polymorphic between ‘920533’ and ‘PI 189225’ using HRM analysis.

Marker name z Chromosome SNP position (bp) y Forward primer (5’→3’) Reverse primer (5’→3’)
WGRS002 1 1,043,418 GGTGGTACCCAATTTGTCCCT AACAGGAAGCCGGCTAGAAA
WGRS006 1 3,819,913 GCGATCAAGAGACAAACGGG TGCGAAGGATGCTTGGTTCT
WGRS011 1 9,325,855 AGGTGCTTAGGAGGTGGAGA CCGCCATGAGAGGAGGTTAG
WGRS017 1 20,202,103 ACGGCAAGCAGTGAAGGTAT GGGGAGAGATGATCGAGCAC
WGRS018 1 22,049,812 TGGGAACTGAGAAGACTGCC GACTTCCACTTCCAACCCCT
WGRS028 1 30,705,477 TGGATATTCCCTCGCTCCAA TTGCTGCTCTTCAAATGGGC
WGRS030 1 33,601,876 GGACAAACCTGGCCCACTAA TCGAAAAGCAGCAGAGGCA

WGRS039 2 13,988,030 AACGGAGCTAATCGACGACC ACAAGGCCCAAGAGATTTAGGA
WGRS046 2 26,782,186 GCCCTGTCAGTGAACCATCA ACAGACCTGAGAATCACTAGCT
WGRS048 2 29,195,322 AGCGTGTGGTTTTGACTTGAG AGATGTAATGCGATGCAGTTGC

WGRS054 3 3,074,543 CGTCTCCAACTCCATCTCCG CTGAGGGGGTTGATGACGAG
WGRS061 3 11,069,946 GTGGGAGGGGAAAACGGATT CATTTTCTTCGGAGCTGGCG
WGRS066 3 20,298,449 TGCAGCCCATGAAAGTGCTA GTGTTTATTGTTCCGCCAGCT
WGRS072 3 25,926,099 GCTCTTCCATTGCTCCTGGA GCAGGGTTCTATGGTCGAGT
WGRS074 3 26,809,484 CGCTATCAGCCGACAAAAGC TCGAGGAAGCTTGCACCAAT

WGRS091 4 5,970,325 TGTGCTGATTGTGGACCTCC AGCTTGCTCATTCCTCTCGT
WGRS095 4 8,233,892 GGTGGCCTCACTATTACCGG GGTTTAGAGGTGGAAGGGGTG
WGRS098 4 10,824,802 TAAGACCCAACCGAACTGCC GCAGGCTGCTCTAACAAAGC
WGRS100 4 13,147,227 TGGTAGAAAATGGCAACGCG GATCAAGGACGGGAATGGGA
WGRS101 4 15,102,363 GGCAAAAGCAGACCCTGTTG CCAGTTCCACCAAGCAAACC
WGRS107 4 17,910,257 TGCCAAGAGAATGCAACACG ATGGAGGACATTGCTTGCCA

WGRS121 5 1,577,748 GGGGTTCCATTCCCTAAGGG GGCGAGATGGTCAAACTCCT
WGRS122 5 2,108,735 AGAACCCCCAACCAAAGCTT TCCCCTGCCTTTGCTTGATT
WGRS124 5 4,255,857 CCAGGCATCCAATCGAGGAA CGTCCATAAAGTTGTGGCCC
WGRS126 5 6,580,137 AGTCCGTTGTCCAGTTTCGA AACAGTAGCCCAAGAGCTGG

WGRS148 6 36,471 GTGCTGCTCCTGGTCTCTAA ACTCAATGGGTGCTTGTGGT
WGRS151 6 1,670,897 GCCATTTGATTCCTCACCGC GAGCTGCCCGTAATGCAATG
WGRS152 6 2,870,018 GCTGCGATCGTGTTCACATC CAGAGGCCAAGACCCAGAAT
WGRS170 6 18,074,367 GCTGTGCTTCTTGTGGCAAA AGAGAACATCAACACGGCGT
WGRS171 6 19,159,722 AGAGCTTTTCGTCATGGCCA TCCAGGTTTGGTTTCCGACA
WGRS172 6 20,013,243 TAGGTCAGCCCTCCCTCAAA CGTTCGAGTAATCCTCCGGG
WGRS174 6 21,093,377 TGGAGTGTTTGACTGTGGGG TCTCCATCTCCAGCCATCCT
WGRS177 6 22,055,693 AAGTGGCAATACCTGACCCC ACTACTCTGCAGCTCATGGC
WGRS186 6 26,890,432 CCTGCTTGTGGACCTGGAAT GCAACCATGCGCACATAACT

WGRS190 7 3,830,477 ATCCGCAGATTCACAGGGAG GGCGCTTAAATCTGGTTCCC
WGRS194 7 6,714,580 CGTTGTTTGCAAGCTCCCAA GCCTCCGCTTCCGATTCTTA
WGRS200 7 16,377,893 AGAATCTTGCCACCTTAGGG TCGGTGGTGACTGAGAAACA
WGRS203 7 21,480,403 AATTGGAGGGTCAAGGGGTG TGCTCGTTTCATCAAAAGCCA
WGRS208 7 26,134,906 TGGGCTACATTGTTCTGCCT GCTTCAAGTTTCCTTGCCTGT
WGRS209 7 27,405,979 TGGTGGTGGAGGCAATCAAA GGGGGTTATGCCTGAAACAA
WGRS212 7 30,620,572 TGCTTGGGTTGTATCACTGACA TGGTGTGGCAGGTAATTGGA
WGRS213 7 31,054,142 AATTCTTTGCGCACTCGTGG ATCCACTCTGAGCAATTGGC

WGRS220 8 7,024,617 AACAGTCAACACCCAGCCTT TTGAGGTGGTCTTTCCGAGC
WGRS221 8 7,889,760 GTGACAACCAAGCAGCACTG TCCTGCCCAACTTGTTCCTC
WGRS225 8 10,733,107 CTTCTGCCATTAAACGCCCA GGGTTCAATCATTGTGGTCACC
WGRS226 8 11,279,464 TGCTGGCCCCACTCAATAAA AGGACCGGGTCTCAATCTCA
WGRS227 8 11,656,539 AGTTCTAACGACACGAGGGC TTGTACCAGACTGCGAGCAA
WGRS229 8 15,003,269 CCTTGTGCAACCAAAGCTGT GACAGCGGTTGCATCAGTTC
WGRS233 8 17,637,101 GTAGACACTCTTAGCCGGGC TCCTGCATTGTGTGGTTCCA
WGRS235 8 18,473,596 ACTGTGTGCACTCACCTGTT CGGACATCTGCTGAGGAGTT
WGRS240 8 20,663,001 ACGGCTGGTCTCATGTTCAA TAGGGTTTGGTGCTGGTGAC

WGRS254 9 4,555,267 TGGCTAACCATGGGTTGCAT AGTTTGTTCCAGCGCCATTG
WGRS263 9 16,573,290 GAGTGCTGATGGAAGCTGGA TGCTCCATATGGAAGCAAGTCA
WGRS271 9 29,654,845 TGCACATTGTGTCACTCTACGA CATTGCCTAGAATTTGCCGGG
WGRS272 9 30,799,073 CTAGATTCCTGCGGATGCCT ACCCATACCTTCTCGCGAAA

WGRS281 10 6,101,884 GCCGGTAGTTTCTGACCCAA AGGTTCAAGAAGTGGCGGAG
WGRS287 10 14,082,501 ACAATGCCTCCACCTTTCCA GTAGCAGCAACAGTGGCAAA
WGRS297 10 27,692,702 TGGCAGTGTTGTACTTGGGT AGGGCTTGGAGACTTTTGCA

WGRS307 11 6,959,074 GAGGGTGAGTTTCTGGTGGG CACGCACACTTCACGCTTAA
WGRS316 11 14,891,680 GTGCCTCTGCTTCTCAGGTT TGGCAGTTTTAGGCTTTTCAGT
WGRS326 11 24,272,773 CAGGTTCCTGAAGCAGCTGA GCTGAATCTACCAGGCAACA

zSNP (HRM) markers developed in this study and WGRS is the abbreviation for watermelon gummy stem blight resistance SNP.

yPosition of SNP on reference genome.

Table 1 Statistics of reference genome C. lanatus subsp.vulgaris cv. 97103.
Table 2 Statistics of raw reads, trimmed reads, and mapped reads obtained from next generation resequencing data.
Table 3 Summary of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and high-resolution melting (HRM) primer sets between watermelon lines ‘920533’ and ‘PI 189225’.
Table 4 List of 61 SNP markers that were developed into HRM marker type. These markers were polymorphic between ‘920533’ and ‘PI 189225’ using HRM analysis.

SNP (HRM) markers developed in this study and WGRS is the abbreviation for watermelon gummy stem blight resistance SNP.

Position of SNP on reference genome.