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ISSN : 0250-3360(Print)
ISSN : 2287-5174(Online)
Korean Journal of Breeding Science Vol.44 No.3 pp.245-257
DOI :

SDS-PAGE 및 PCR 을 활용한 국산 밀 품종의 글루텐닌 조성 분석

신상현1, 강천식1, 김경훈1, 박철수2*
1국립식량과학원, 2전북대학교 농업생명과학대학 작물생명과학과

Analysis of Glutenin Compositions in Korean Wheat Cultivar Using SDS-PAGE and PCR

Chul Soo Park2*, Sanghyun Shin1, Chon-Sik Kang1, Kyung-Hoon Kim1
2Department of Crop Science and Biotechnology, Chonbuk National University
1National Institute of Crop Science, RDA
(Received on May 25, 2012. Revised on August 20, 2012. Accepted on August 27, 2012)

Abstract

PCR-based assays with co-dominant or dominant allele-specific STS (sequence tagged sites) markers and sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) have been used to discriminate Glu-1 and Glu-3 alleles inKorean wheat cultivars. Three alleles were identified at each high molecular weight glutenin (Glu-1) homoeologous locus and10 alleles were identified at low molecular weight glutenin (Glu-3) homoeologous locus in Korean wheat cultivars. At Glu-1 loci,wheat cultivars contained Glu-A1a, b and c alleles amplified three fragments of 1093, 1063 and 920bp, and Glu-B1b, c and falleles discriminated with 707bp (Glu-B1b and f) and 662bp (Glu-B1c) fragments and Glu-D1a, d and f alleles amplified twofragments576bp (Glu-D1d) and 612bp (Glu-D1a and f), respectively. At Glu-3 loci, wheat cultivars contained Glu-A3c, d ande alleles amplified a 573bp, 967bp and 158bp fragments, respectively, Glu-B3d, g, h and i alleles gave a 662bp, 853bp, 1022bpand 621bp, respectively and c) bands and Glu-D3a, b and c alleles amplified a 884bp (Glu-D3a and b) and 338bp (Glu-D3c)fragments. A multiplex-PCR assay was also established which permitted the discrimination of the major Glu-1 and Glu-3 todetermine glutenin compositions in a single PCR reaction and agarose gel assay because these systems could be useful to selectDNA-based identification of wheat lines carrying good bread making performance in Korean wheat breeding programs. Threemultiplex-PCRs for Glu-1 and Glu-3, Glu-A1c/ Glu-B1acf/Glu-D1d, Glu-A3ac/Glu-A3d/Glu-A3e and Glu-B3d/Glu-B3fg /Glu-B3hwere established in this study.

04_2012-OB-0154_박철수.pdf1.73MB

서 언

 밀 육종 프로그램에서 품질 향상을 위한 선발 효율성 증진, 특히 육종 초기 세대에서 품질이 우수한 계통을 선발하는 것은 매우 중요하다. 밀은 다양한 가공적성을 지녀 가공제품의 품질에 관여하는 유전자의 특성을 규명하기 위하여 많은 단백질 및 DNA 표지인자가 이용되고 있다(Gale 2005). 밀의 가공 적성은 주로 단백질의 양과 질적 특성에 의해 결정되기 때문에 품질 향상을 위한 표지인자의 활용은 반죽 형성시 점탄성을 결정하는 글루텐 특성에 관련된 질적 형질 개선에 주로 이용되고 있다(D’Ovidio and Masci 2004). 밀의 저장 단백질인 글루텐은 단량체로 구성되어 알코올에 분해되는 글리아딘과 다량체로 구성되어 불용해성인 글루텐닌으로 구성되어있는데 글루텐의 점탄성은 주로 글루텐닌이 결정한다. 글루텐닌은 SDS-PAGE(sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용한 분석에서 분자량에 따라 HMWGS (high-molecular-weight glutenin subunits, 80-130 kDa) 과 LMW-GS(low-molecular-weight glutenin subunits, 30-51 kDa)로 구별된다(Gianibelli et al. 2001).

HMW-GS 는 밀 글루텐의 10%를 차지하지만 글루텐의 탄성을 결정하는데 있어서 매우 중요하기 때문에 빵을 만드는데 중요한 요인으로 작용 한다. 이러한 HMW-GS 를 조절하는 유전자는 1 번 염색체 장완(long-arm)에 위치해 있으며, 이들 유전자좌는 각각 Glu-A1, Glu-B1 과 Glu-D1 으로 명명되었다(Payne 1987). Glu-A1 유전자좌는 단백질 발현이 안되거나 한 개의 단백질이 발현되고, Glu-B1 유전자좌는 한 개나 두개의 단백질이 발현되고 Glu-D1 유전자좌에서는 두개의 단백질이 발현되어 HMW-GS 는 최소 3 개에서 최대 5 개의단백질로 구성된다(Payne 1987). Payne and Lawrence(1983)는 HMW-GS 와 제빵 적성간 상관관계 분석을 통하여, 각각의 HMW-GS 의 제빵 능력을 점수화하여 Glu-1 점수 체계를 확립하였고, 이를 통하여 제빵능력을 간편하고 정확하게 예측 할 수 있다고 하였다. 이후 Glu-1 점수 체계를 이용하여 세계 각국의 품종, 계통 및 유전자원에 대한 평가가 이루어졌다(Payne and Lawrence 1983, Payne et al. 1983, Payne et al. 1987, Branlard et al. 2003, Graybosch 1992, Hong and Park 1998, Redaelli et al. 1997). 현재 세계 각국은 빵용 밀 품종 육성을 위해 HMW-GS 분석이 적극적으로 활용되고 있다.

LMW-GS 는 글루텐의 40%를 차지하고 있으며, 반죽의 인장력을 결정하는 중요한 역할을 하고 HMW-GS 와 결합을 통하여 글루텐의 점탄성을 결정하는데 기여한다(Gianibelli et al. 2001). LMW-GS 를 조절하는 유전자는 1 번 염색체 단완(short-arm)에 위치해 있으며, 이들 유전자좌는 각각 Glu-A3, Glu-B3 및 Glu-D3 으로 명명되었다(Singh and Shepherd 1988). 그러나, LMW-GS 를 발현하는 Glu-3 유전자좌와 γ 및 ω 글리아딘 발현에 관여하는 Gli-1 유전자좌가 밀접하게 연관되어 있기 때문에 단백질 발현이 중복되어 LMW-GS 분석에 어려움이 많아 HMW-GS 에 비하여 연구가 활발하지 못하였다(Jackson et al. 1996). SDS-PAGE 분석으로 LMW-GS 발현 패턴을 정리한 결과, Glu-A3 유전자좌에서 6 개의 패턴이 발현되고, Glu-B3 유전자좌에서는 9 개의 패턴이, Glu-D3 유전자좌에서 5 개의 패턴이 발현되어 전체적으로 20 개의 LMW-GS 밴드 패턴을 보고하였다(Gupta and Shepherd 1990). 이러한 LMWGS 밴드 패턴을 기준으로 최근 들어 밀 품종 및 유전자원에 대한 평가와 LMW-GS 조성이 제빵에 미치는 영향에 대한 평가가 이루어지고 있다(Branlard et al. 2001, 2003, Flaete and Uhlen 2003, Shan et al. 2007, Park et al. 2011). 

제빵 능력 향상을 위한 밀 육종 프로그램에 있어서 SDSPAGE를 이용한 글루텐닌 분석이 많이 이용되고 있지만, 이러한 방법은 분석에 있어서 상당한 시간과 노력이 많이 든다. DNA 표지인자를 활용하면 분석 시간이 단축되고 한번의 DNA 추출로 여러 가지 형질 분석이 가능하기 때문에 최근 들어 글루텐닌 관련 유전자서열 특이적(STS, sequence tagged site) 분자표지를 활용한 분석이 많이 이루어지고 있으며(Gale 2005), 육종의 효율성을 높이고자 Glu-1 및 Glu-3 의 multiplex PCR 마커를 활용하는 연구가 수행되고 있다(Salmaowicz and Moczulski 2004, Zhang et al. 2008, Liang et al. 2010, Sui et al. 2010, Wang et al. 2010). 최근 들어 국내산 밀의 재배면적이 증가하고 소비자의 국산밀 소비가 증가함에 따라 국내 밀 품종의 품질 향상이 어느 때 보다 중요하다고 할 수 있다. 국내 밀 품종이 외국산과 대등한 수준의 글루텐닌 조성을 지니기 위해서는 글루텐닌 관련 인자 탐색이 중요하며 이러한 자원 탐색을 통하여 유용 인자를 집적시키는 것이 중요하다. 본 연구는 국산 밀 품종에 대해 Glu-1 과 Glu-3 의 DNA 표지인자를 이용한 선발과 multiplex PCR 을 활용한 글루텐닌 분석 방법을 체계화를 하여 국내 밀 육종 프로그램에서 빵용 밀 육종 선발의 효율성 증진을 위한 기초 자료로 이용하고자 수행하였다.

재료 및 방법

공시재료

본 연구에 사용된 재료는 농촌진흥청 국립식량과학원 벼맥류부 증식 포장에서 전작조건으로 재배하여 2011년에 수확된 금강밀 등 24 품종을 이용하였다. 

SDS-PAGE를 이용한 글루텐닌 조성 분석

분쇄된 종실 40 mg 을 50% 프로판올로 65℃에서 20 분 동안 침지하여 글리아딘을 추출하고 원심분리 후 상등액은 글리아딘 조성 분석을 위한 Gli-B1 분석에 이용하였다. 상등액을 24 시간 동안 알콜을 증발시킨 후에 400 μl 의 sample buffer [2%(w/v) SDS, 40%(v/v) glycerol, and 0.023%(w/v) bromophenol blue]를 추가한 후 90℃에서 5 분간 방치 후 SDS-PAGE 를 실시하였다. 글리아딘이 제거된 나머지 침전물에 extraction buffer [50%(v/v) propanol, 0.08 M Tris-HCl, pH 8.0] 100 μl 을 추가하여 65℃에서 30 분간 방치하고 원심분리 후 상등액에 상등액과 같은 양의 sample buffer 를 추가하여 90℃에서 5 분간 방치 후 SDS-PAGE 를 실시하였다. SDS-PAGE 를 이용한 글루텐닌과 글리아딘 조성 분석을 위한 separating gel 의 acrylamide 농도는 14.0%를 이용하였으며, 1 M Tris buffer(pH 8.5)를 사용하여 15 mA/gel 조건으로 20 시간 분리하였다. 전기영동 후에 젤을 commassie blue R-250 로 18 시간 염색한 후에 10% trichloroacetic acid 로 24 시간 destaining 하였다. HMW-GS 조성 분석은 Payne and Lawrence(1983) 방법, LMW-GS 의 Glu-A3 과 Glu-D3 의 분석은 Singh et al. (1991)의 방법, Glu-B3 의 분석은 Glu-B3 가 Gli-B1 과 연관 되어있기 때문에 글리아딘도 함께 분석을 하였으며, Jackson et al.(1996)과 Peña et al.(2004)방법에 따라 평가하였다.

Genomic DNA 추출

국산밀 24품종을 온실에서 3주간 생육시켜 자란 식물체의 3엽을 채취하여 액체질소로 급속냉동 시킨 후 유발을 이용하여 미세분말로 분쇄한 뒤 -70℃에 보관하였다. Genomic DNA는 잎 분말(100 mg)로부터 식물용 genomic DNA 분리시약 (Solgent, Korea)을 이용하여 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 Nanodrop 1000 spectrophotpmeter(Thermo Scientific, Wilmington, USA)를 사용하여 정량하였고, -20℃에 보관하여 사용하였다. 

Multiplex-PCR 분석

Glu-1 분석을 위하여 관련 유전자서열 특이적 분자표지인 Glu-A1(Lafiandra et al. 1997, Radovanovic and Cloutier 2003), Glu-B1(Lei et al. 2006)과 Glu-D1(D’Ovidio and Anderson 1994, Smith et al. 1994)을 이용하였고, Glu-3 분석을 위하여 Glu-A3(Wang et al. 2010), Glu-B3(Wang et al. 2009)과 Glu-D3(Zhao et al. 2007a, b)을 이용하여 PCR을 수행하였다. Glu-1과 Glu-3 분석을 위한 primer는 각기 다른 염기서 열의 forward와 reverse 한 쌍으로 이루어져 있다(Table 1). PCR은 Veriti® Dx 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystem, USA)을 사용하였다. Glu-1과 Glu-3 관련 각각의 유전자서열 특이적 분자표지 분석을 위한 PCR 조성은, genomic DNA은 100 ng이었으며, primer는 각각 0.5 μmol/l를, MgCl2와 dNTP는 각각 2.0 mmol/l을, Taq polymerase (Genetbio Prime DNA polymerase, Korea)는 1 unit을 사용하였으며, 총 반응액은 25 μl로 하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 변성반응을 거친 후, 증폭단계에서 94℃에서 30초, 각각의 유전자에 맞는 annealing 온도(Table 1)에서 30초, 72℃에서 60초를 35회 반복하여 진행한 후 최종 신장반응은 72℃에서 10분간 수행하였다. Multiplex-PCR 분석을 위하여 Glu-1과 Glu-3 분석에 이용된 primer 중에서 빵용 선발에 필요한 3쌍의 유전자서열 특이적 분자표지를 이용하여 Glu-1, Glu-A3와 Glu-B3의 유전자서열 특이적 분자표지를 이용하여 분석하였다(Table 2). PCR 산물은 EtBr(0.5 μg/ml)이 포함된 2.0% agarose gel에 서 100 V로 2시간 동안 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.

Table 1. Sequence of primers for identification of individual Glu-1 and Glu-3 alleles and expected PCR fragment size

Table 2. Conditions of multiplex-PCR for Glu-1 and Glu-3 alleles in Korean wheat cultivars

결과 및 고찰

SDS-PAGE와 Multiplex-PCR을 이용한 Glu-1 분석

SDS-PAGE 와 PCR 을 이용하여 국내 밀 품종의 Glu-1 조성을 분석한 결과는 Table 3 과 같다. SDS-PAGE 분석에서(Fig. 1), 3 개 유전자좌 변이를 나타내어 총 9 개의 유전적 변이를 나타내었고, Glu-A1c, Glu-B1b 와 Glu-D1f 의 비율이 각각 62.5%(15 개), 66.7%(16 개)와 66.7%(16 개)로 높은 발생 빈도를 나타내었다. 이 같은 결과는 Park et al.(2009)의 결과와 일치하였고, 외국 밀 품종의 유전적 변이와 비교하였을 때, Glu-B1b 의 높은 발생 빈도는 차이가 없었지만, Glu-A1c 와 Glu-D1f 의 높은 발생 빈도는 일본 밀 품종에서 나타나는 특성과 유사하였고, Glu-A1c 발생 빈도는 프랑스 밀 품종과 유사하였다(Oda et al. 1992, Branlard et al. 2003). 특히, 국내 밀 품종에서 발생 빈도가 높은 Glu-D1f 을 지닌 품종은 단백질 함량이 비슷한 미국 밀 품종과 비교하였을 때 침전가와 반죽시 가수량이 높았지만 제빵 적성은 열악한 것으로 나타났다(Park et al. 2006). Shewry et al.(1992)은 빵용에 적합한 품종은 Glu-1 조성에 있어서 Glu-A1a 이나 b, Glu-B1b 이나 i 과 Glu-D1d 을 지니고 있어야 한다고 제안하였고, 이들 조성은 Payne(1987)이 제안한 Glu-1 점수 체계에서 10 점으로 평가된다. 국내 밀 품종 중에서는 금강밀, 알찬밀, 조경밀, 조농밀 및 탑동밀이 이에 해당하며 이들 품종은 외국산 빵용 밀 품종보다 제빵적성은 떨어졌지만, 국내 밀 품종들 중에서는 제빵적성이 양호한 것으로 나타났다(Park et al. 2011).

Table 3. Allelic variations at Glu-1 in 24 Korean wheat cultivars indentified by multiplex PCR analysis and SDS-PAGE

Fig. 1. One-dimensional SDS-PAGE patterns of reduced and alkylated glutenin subunits for allelic variations of Glu-1 in Korean wheat cultivars. 1, Anbaek; 2, Eunpa; 3, Geuru; 4, Joeun; 5, Jokyung; 6, Jopoom; 7, Ol; 8, Olgeuru; 9, Shnmichal1; 10, Tapdong; 11, Uri; 12, Younbaek.

 HMW-GS 유전자 서열로부터 제작된 STS 분자표지를 이용하여 국내 밀 품종의 분자표지 양상을 확인한 결과(Fig. 2), Glu-A1 에서는 국내 밀 품종에서 발생 빈도가 높은 Glu-A1c 는 920 bp 를 나타났고, 제빵에 적합한 조성인 Glu-A1a 와 b 는 공우성 표지인자로 두 개의 밴드가 나타났는데 Glu-A1a 는 1093 bp, Glu-A1b 는 1063 bp 를 나타내었다(Fig. 2-A). 본 연구에서는 HMW-GS 와 LMW-GS 분석을 동시에 수행하기 위하여 acrylamide 농도를 14%에서 10%로 낮추었을 때 Glu A1b 와 Glu D1a 구별이 가능하였다. Glu-B1 은 Glu-A1 과 Glu-D1 에 비하여 유전적 변이가 다양하게 보고되었지만(Lei et al. 2006, Xu et al. 2008), 국내 밀 품종은 Glu-B1b, c 와 f 로 나타나고 있기 때문에 공우성 표지인자를 이용하여 분리가 가능하였다. Glu-B1c 는 662 bp 를 나타내었고, 국내 밀 품종에서 발생 빈도가 높은 Glu-B1b 와 f 는 707 bp 로 나타났다(Fig. 2-B). 특히, Glu-1 점수 체계에서 Glu-B1b 와 f 는 3 점을 나타내고 Glu-A1c 는 2 점을 나타내기 때문에 빵용 밀 계통 육성에 있어서 Glu-B1bcf 표지인자는 유용하게 활용할 것으로 생각된다. Glu-D1 분석을 위하여 D1a, d 와 f 를 구별하는 공우성 표지인자를 이용한 결과, 두 개의 밴드가 나타나는데 Glu-1 점수 체계에서 4 점을 나타내어 빵용 밀에 있어서 반드시 필요한 Glu-D1d 은 343 bp 및 320 bp 를 나타내었고, 2 점인 Glu-D1a 와 국내 품종에서 빈도가 높게 나타나는 Glu-D1f 은 361 bp 를 나타내었다(Fig. 2-C). 이러한 Glu-D1adf 는 빵용 밀 품종 선발에 있어서 Glu-D1d 을 지닌 품종 선발에 효과적으로 이용될 것으로 생각된다.

Fig. 2. Agarose gel electrophoresis of PCR amplified Glu-A1 (A), B1 (B) and D1 (C) in Korean wheat cultivars. M, molecular size marker; 1, Anbaek; 2, Eunpa; 3, Geuru; 4, Joeun; 5, Jokyung; 6, Jopoom; 7, Ol; 8, Olgeuru; 9, Shnmichal1; 10, Tapdong; 11, Uri; 12, Younbaek.

국내 밀 품종의 Glu-1 조성 분석을 위한 multiplex-PCR 결과는 Fig. 3 과 같다. 공우성 표지인자를 모두 이용하여 multiplex-PCR 을 실시한 결과 Glu-B1 만 분석이 가능하였다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 multiplex-PCR 은 Table 2 에서와 같이 Glu-A1c, Glu-B1bcf 와 Glu-D1d 표지인자를 활용하여 국내 밀 품종을 분석하였다. 분석결과 국내 밀 품종에서 Glu-1 점수가 10 점인 품종은 Glu-B1b, f 와 Glu-D1d 유전자를 지니기 때문에 707 bp 및 450 bp 밴드를 나타내었고, 그 외 품종은 Glu-A1c 와 Glu-B1c 또는 Glu-B1b 와 f의 발현으로 인하여 920 bp 및 707 bp 밴드 또는 920 bp 및 662 bp 밴드를 나타내었다. 이러한 결과는 Glu-1 조성 분석이 multiplex-PCR 로 가능하다는 것을 보여 주고 있으며, 이를 활용하여 국내 밀육종 집단의 육종 초기 세대에 빵용 밀 계통 선발이 가능할 것으로 생각한다. 국산 밀의 제빵력 향상을 위해서는 기본적으로 Glu-1 점수가 10 점이 되는 조성을 가진 계통을 육성해야 하기 때문에 Glu-A1c 와 Glu-D1f 을 선발에서 제외하고 Glu-A1a 이나 b 와 Glu-D1d 중심으로 선발이 이루어져야 할 것이다. 

Fig. 3. Multiplex-PCR patterns amplified by three pairs of primers for Glu-1, Glu-A1c/Glu-B1acf/Glu-D1d in agarose gel. M, molecular size marker; 1, Alchan; 2, Cheonggye; 3, Geuru; 4, Gobun; 5, Jinpoom; 6, Jonong; 7, Keumkang; 8, Milsung; 9, Namhae; 10, Saeol; 11, Seodun; 12, Shinmichal 1.

SDS-PAGE와 Multiplex-PCR을 이용한 Glu-3 분석

 국내 밀 품종의 Glu-3 조성을 SDS-PAGE와 PCR을 이용하여 분석한 결과는 Table 4와 같다. SDS-PAGE 분석에서(Fig. 4), 국산 밀 품종은 Glu-A3 유전자좌에서 3개의 변이를 나타내었으며, Glu-A3d를 나타내는 품종이 알찬밀 등 12개 품종으로 발생 빈도가 제일 높았고, 이 같은 경향은 일본이나 프랑스 밀 품종과 유사하였고, 미국, 중국, 호주 및 아르헨티나 빵용 밀 품종에서는 Glu-A3a, b와 f 발생 빈도가 높은 것으로 나타났다(Eagles et al. 2002, Branlard et al. 2003, Tanaka et al. 2005, Shan et al. 2007, Li et al. 2009, Lerner et al. 2009). 외국 품종의 제빵력 평가에 있어서, Glu-A3b나 Glu-A3d를 지닌 품종이 반죽의 점탄성이 강하여 제빵에 적합하였고, Glu-A3e는 반죽의 힘이 약하여 제빵에 부적합하다고 알려져있다(Gupta et al. 1989, 1991, Metakovsky et al. 1990, Branlard et al. 2001, Eagles et al. 2002, Vawser et al. 2002). 국내 밀 품종에 있어서 Glu-A3d를 지닌 품종은 Glu-A3e를 지닌 품종에 비하여 반죽시간이 길게 나타났고, Glu-A3b는 국내 밀 품종에서 탐색되지 안았다(Park et al. 2011).

Table 4. Allelic variations at Glu-3 in 24 Korean wheat cultivars indentified by multiplex PCR analysis and SDS-PAGE

Fig. 4. One-dimensional SDS-PAGE patterns of reduced and alkylated glutenin subunits for allelic variations of Glu-3 (A) and Gli-1 (B) in Korean wheat cultivars. 1, Anbaek; 2, Eunpa; 3, Geuru; 4, Joeun; 5, Jokyung; 6, Jopoom; 7, Ol; 8, Olgeuru; 9, Shnmichal1; 10, Tapdong; 11, Uri; 12, Younbaek.

국산 밀 품종은 Glu-B3에서 4개의 유전적 변이를 나타내었으며, Glu-B3d가 알찬밀 등 15개 품종에서 나타나 가장 높은 빈도를 보였고, 밀성밀, 올밀, 신미찰밀, 연백밀등 4품종 외 11품종은 Glu-A3d를 나타내었다. Jackson et al.(1996)은 Glu-B3 단백질 발현은 Gli- B1 발현과 밀접한 관련이 있으며, Peña et al.(2004)은 SDS-PAGE를 이용한 Glu-B3 와 Gli-B1 단백질 발현 양상을 본 결과(Fig. 4-B), Glu-B3b는 Gli-B1b와 Glu-B3d는 Gli-B1h와, Glu-B3f는 Gli-B1g와, Glu-B3g 는 Gli-B1f와, Glu-B3h는 Gli-B1d와, Glu-B3i는 Gli-B1k와, Glu-B3j는 Gli-B1l과 발현 양상이 같이 나타난다고 보고하였다. 국내 밀 품종에서 발현이 높은 Glu-B3d는 중국 품종에서는 비교적 높은 발생 빈도를 나타내었지만, 다른 나라 밀 품종에서는 발생 빈도가 매우 낮게 나타났다(Eagles et al. 2002, Branlard et al. 2003, Tanaka et al. 2005, Shan et al. 2007, Lerner et al. 2009, Li et al. 2009). 국내 밀 품종 중에서 Glu-B3d 와 h를 지닌 품종이 Glu-B3i를 지닌 품종보다 반죽의 강도가 높은 것으로 나타났다(Park et al. 2011). Peña et al.(2004)은 Glu-B3d가 반죽 강도가 제일 강하여 제빵력이 가장 우수하였고, 다음으로 Glu-B3b, f 와 g가 양호하였으며, Glu-B3i 와 h는 반죽 강도가 제빵에는 부적합한 것으로 보고하였다. 국내 밀 품종에서 Glu-B3h를 지닌 품종이 제빵력이 양호하게 나타난 것은 Glu-1 점수가 10점인 금강밀, 조경밀과 조농밀이 Glu-B3h를 지니고 있기 때문으로 나타났다(Park et al. 2011). 

 국산 밀 품종은 Glu-D3 에서 3 개의 유전적 변이를 나타내었으며, Glu-D3a 가 15 개 품종에서 나타나 가장 높은 빈도를 나타내었지만, 호주, 프랑스나 아르헨티나 품종에서는 발생 빈도가 매우 낮았으며, 미국 품종은 Glu-D3 유전자의 분포가 고르게 나타내었다(Eagles et al. 2002, Branlard et al. 2003, Shan et al. 2007, Lerner et al. 2009). 국산 밀 품종에 있어서 Glu-D3b 를 지닌 품종이 반죽강도가 우수한 것으로 나타났는데(Park et al. 2011), 이러한 결과는 호주나 뉴질랜드 밀품종에서도 같은 양상으로 나타났다(Gupta et al. 1989, 1991, Metakovsky et al. 1990, Luo et al. 2001). 그러나, 프랑스밀 품종에서는 Glu-D3a 가 다른 유전자보다 제빵에 적합한 것으로 나타났고(Branlard et al. 2001), 다른 외국 밀 품종에 있어서는 Glu-D3 유전자는 제빵력에 미치는 영향이 차이가 없는 것으로 나타났다(Vawser et al. 2002). 그러므로, 국산밀의 제빵력 향상을 위해서는 우선적으로 유전적 다양성 확보를 하는 것이 중요한데, 특히 Glu-A3a, b 및 f 와 Glu-B3b, f 및 g 등 자원 도입이 필요하다. 밀 육종 프로그램에서 빵용 밀 계통 선발을 위해서는 우선적으로 Glu-1 점수가 10 점인 계통을 선발하고 이러한 계통 중에서 Glu-A3b 나 d 와 Glu-B3b, d, f 나 g 를 지닌 계통을 선발한다면 국내 밀 품종의 제빵력 향상이 가능할 것으로 생각한다.

LMW-GS 유전자 서열로부터 제작된 STS 분자표지를 이용하여 국내 밀 품종의 분자표지 양상을 확인한 결과(Fig. 5), Glu-A3 에서는 국내 밀 품종은 4 개의 밴드 패턴으로 나타났는데(Fig. 5-A), 발생 빈도가 높은 Glu-A3d 는 967 bp 를 나타내었고, Glu-A3a 와c 는 573 bp 를 나타냈고 이들 중에 Glu-A3a 는 529 bp 를 나타내어 구별이 가능하였고, Glu-A3e 를 지닌 국산 밀 품종은 158 bp 를 나타내었다. Wang et al.(2010)은 Glu-A3 분석을 위한 7 개의 유전자 특이적 표지인자를 보고하였고, 국내산 밀 품종의 분석 결과는 이들의 보고와 일치하였다. Glu-B3 도 4 개의 밴드 패턴으로 나타내었는데(Fig. 5-B), 발생 빈도가 높은 Glu-B3d 는 662 bp 를 나타내었고, Glu-B3g, h 와 i 는 각각 853, 1022 와 621 bp 를 나타내었다. Wang et al.(2009)은 10 개의 Glu-B3 유전자 특이적 표지인자를 보고하였고, 국산 밀 품종의 분석 결과는 이들의 보고와 일치하였다. Glu-D3 는 3 개의 밴드 패턴으로 나타내었는데(Fig. 5-C), 발생 빈도가 높은 Glu-B3a 는 Glu-B3b 와 같은 884 bp 를 나타내었고, Glu-D3c 는 388 bp 를 나타내었는데 이러한 결과는 Zhao et al.(2007a, b)의 보고와 일치하였다. 현재까지 Glu-D3a 와 b 를 분리하여 분석할 수 있는 표지인자는 보고되어있지 않지만, Glu-D3 가 제빵에 미치는 영향이 아직 명확하지 않고, 각 유전자별로 명확히 구별할 수 있는 표지인자가 보고되어 있지 않기 때문에 Glu-3 관련 DNA 표지인자를 활용한 제빵력 평가에 있어서 Glu-D3 는 Glu-A3 나 Glu-B3 에 비해 활용이 낮기 때문에 본 연구에서는 multiplex-PCR 을 이용한 Glu-3 분석에 있어서 Glu-D3 분석은 제외하였다.

Fig. 5. Agarose gel electrophoresis of PCR amplified Glu-A3 (A), B3 (B) and D3 (C) in Korean wheat cultivars. M, molecular size marker; 1, Anbaek; 2, Eunpa; 3, Geuru; 4, Joeun; 5, Jokyung; 6, Jopoom; 7, Ol; 8, Olgeuru; 9, Shnmichal1; 10, Tapdong; 11, Uri; 12, Younbaek.

국산 밀 품종의 Glu-3 조성 분석을 위한 Glu-A3 와 Glu-B3 의 multiplex-PCR 결과는 Fig. 6 에서 보는 바와 같다. 현재까지 Glu-A3 와 Glu-B3 의 multiplex-PCR 분석은 유전자간 염기서열의 유사성이 높기 때문에 각각 2 개의 유전자에 대한 multiplex-PCR 분석이 가능하였다(Sui et al. 2010, Wang et al. 2010). 국산 밀 품종은 Glu-A3 에서 Glu-A3c, d 와 e 가 발현되었고, 외국 품종의 경우 Glu-A3b 를 지닌 품종이 제빵 적성이 좋은 것으로 나타났기 때문에 Glu-A3ac, Glu-A3d 와 Glu-A3e 를 multiplex-PCR 을 실시한 결과(Fig. 6-A), 각각 573 bp, 967 bp 과 158 bp 를 나타내어 multiplex-PCR 을 이용하여 국산 밀 품종의 Glu-A3 분석이 가능하였다. 국산 밀 품종은 Glu-B3 에서 Glu-B3d, g, h 와 i 가 발현되었고, 제빵적성이 불량한 것으로 보고된 Glu-B3i 를 제외하고 Glu-B3d, Glu-B3fg 와 Glu-B3h 를 multiplex-PCR 을 실시한 결과(Fig. 6-B), 각각 662 bp, 812 bp 과 1022 bp 를 나타내어 multiplex-PCR 을 이용하여 국내 밀 품종의 Glu-B3 분석이 가능하였다. 이러한 결과를 통하여 국내 밀 품종에 대해서도 multiplex-PCR 을 이용하여 Glu-A3 와 Glu-B3 분석이 가능하다는 것을 증명하였고, 국내 밀 육종 집단이나 도입 유전자원의 평가에서 유용하게 활용이 가능할 것으로 전망된다.

Fig. 6. Multiplex-PCR patterns amplified by two pairs of primers for Glu-3, Glu-A3ac/Glu-A3d/Glu-A3e (A) and Glu-B3d/Glu-B3fg/ Glu-B3h (B) in agarose gel. M, molecular size marker; 1, Olgeuru; 2, Seodun; 3, Shinmichal 1; 4, Jopoom; 5, Gobun; 6, Uri; 7, Tapdong; 8, Jinpoom; 9, Alchan; 10, Namhae; 11, Joeun; 12, Ol.

적 요

국내 밀 육종 시스템의 빵용 밀 육종 선발의 효율성을 높이고자 국내산 밀 품종을 이용하여 Glu-1 과 Glu-3 의 DNA 표지인자를 이용한 유전자형 확인과 multiplex-PCR 을 이용하여 Glu-1 과 Glu-3 을 분석하였다. 글루텐닌 발현에 연관된 유전자 서열 특이적 분자표지인 Glu-1 과 Glu-3 의 밴드 패턴은 SDS-PAGE 를 이용하여 분석한 글루텐닌 조성 분석 결과와 일치하였으며, multiplex-PCR 을 이용하여 Glu-1 분석하였고, Glu-3 의 경우 제빵 적성에 연관되거나 국내 품종에서 특이적으로 발현되는 Glu-A3 와 Glu-B3 의 분석이 가능하였다. 이러한 결과는 국내 밀의 유전적 다양성을 확보하기 위한 자원 도입을 위한 평가와 육종 초기세대 계통에서 글루텐닌의 유전적 분석에 이용이 가능하기 때문에 국내 밀 육종 시스템에서 유용하게 적용될 것으로 생각한다. 

사 사

본 논문은 차세대 바이오그린 과제 PJ008006의 지원에 의해 이루어진 연구 결과의 일부임. 

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